大学研究生课程-色谱概论-研究生

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1、1,色谱分析 -研究生,2,第一章 色谱分析法概论,第一节 色谱法概述,一、什么是色谱法色谱分析法简称色谱法(chromatography),是一种物理或物理化学分离分析方法。,3,图示,固定相CaCO3颗粒 流动相石油醚,4,第二节 色谱法的分类与历史,一、色谱法的历史 1.新型固定相和检测器的研制 2.色谱新方法的研究 3.色谱联用技术 4.色谱专家系统,5,二、分类:,1按两相分子的聚集状态分: 流动相 固定相 类型,6,续前,2按操作方式分:,7,3按分离机制分:,8,图示,色谱法简单分类,9,第二章 色谱基本理论,定性参数 定量参数 柱效参数 分离参数 相平衡参数,第一节 色谱参数,

2、10,续前,(一)色谱流出曲线和色谱峰 1色谱流出曲线 是由检测器输出的电信号强度对时间作图所绘制的曲线,又称为色谱图。2基线 是在操作条件下,没有组分流出时的流出曲线。,一、色谱流出曲线和有关概念,11,12,3色谱峰 是流出曲线上的突起部分。 正常色谱峰为对称形正态分布曲线。不正常色谱峰有两种:拖尾峰和前延峰。色谱峰的对称与否可用对称因子fs (symmetry factor) ,或叫拖尾因子(tailing factor),来衡量。,13,对称因子在0.951.05之间的色谱峰为对称峰; 小于0.95者为前延峰。 大于1.05者为拖尾峰。,14,15,二、定性参数,(一)保留值 1保留时

3、间 (retention time;tR) 是从进样到某组分在柱后出现浓度极大时的时间间隔,即从进样开始到某个组分的色谱峰顶点的时间间隔。 2死时间 (dead time;t0) 是分配系数为零的组分,即不被固定相吸附或溶解的组分的保留时间。,16,17,3调整保留时间 (adjusted retention time; ),4保留体积(retention volume;VR) 是从进样开始到某个组分在柱后 出现浓度极大时,所需通过色谱柱的 流动相体积。,18,5死体积 (dead volume;V0),19,6调整保留体积(adjusted retention volume;) 与流动相流速

4、无关 7相对保留值(relative retention;r),20,8保留指数(retention index;I) 又称Kovats指数,定义式如下:,Ix-待测组分的保留指数 z与z+n-正构烷烃对的碳原子数 n可为1、2,通常为1。,21,规定正己烷、正庚烷、正辛烷的保留指数分别为600、700、800,依次类推。同系物中,每增加1个CH2,保留指数增加100。例如 在阿皮松柱上,测定某样品的保留指数,测得数据如下:,22,tR t0 样品 乙酸正丁酯 340s 30s 物质对 正庚烷(Z) 204s 正辛烷 (Z+n) 403.4s,说明乙酸正丁酯的保留行为,相当于 7.756个碳的

5、正构烷烃的保留行为。,23,三、柱效参数,(一) 色谱峰区域宽度 1标准差(standard deviation;) 是正态色谱流出曲线上两拐点间距离之半。 越大,组分越分散;反之越集中。,24,25,2半峰宽(peak width at half height;W1/2) 是峰高一半处的峰宽。 W1/2=2.355 3峰宽 (peak width;W) 是通过色谱峰两侧拐点作切线在基线上所截得的距离。 W=4 或 W=1.699W1/2,26,(二)理论塔板数和理论塔板高度,1. 理论塔板数,27,28,2. 理论塔板高度,29,四、分离参数,若R=1, 4分离, 两峰基本分开。 若R=1.

6、5,6分离,两峰完全分开(基 线分离)。,30,2.基本分离方程式,(1)柱色谱,31,a项取决于柱效,n,a项 b、c项相关 在GC中:b项主要受色谱柱性质影响c项主要受柱温影响 在HPLC中:b项主要取决于流动相的种类c项主要取决于流动相的配比,32,(2)薄层色谱:,讨论: a项为薄层板板效项。N,斑点越集中,R。 b项为选择项。选择合适的流动相,提高。 c项为容量项。Rf2,R。最佳分离条件:Rf值在0.30.5。调整展开剂极性,使Rf值落入最佳范围。,33,(二)有效峰数(effective peak number,ENP),ENP的含义:在含有Z与Z+1个碳的正构同系物的色谱峰间能

7、容纳的色谱峰数。 ENP越大,色谱柱的分离性能越好。,34,例如:在一个20m0.24mm内径的WCOT柱,固定液为Carbowax 20M,柱温80,测定正构醇同系物得:正戊醇、正己醇和正庚醇的保留时间分别为:554.0,870.6和1459.2s,色谱峰宽分别为:7.54,12.03和20.40s。用正戊醇、正己醇的数据计算ENP,35,(三)分离值,1.分离值在柱色谱中的定义和含义,36,例1 若RZ+1/Z=6,R*1.5,则SV=3. 说明在含有Z与Z+1个碳的同系物的色谱峰间能容纳3个色谱峰。 例2 若RZ+1/Z=6,R*1.0,则SV=5. 说明在含有Z与Z+1个碳的同系物的色

8、谱峰间能容纳5个色谱峰。,37,38,2.在薄层色谱法中的定义和含义,R-Rf=0和Rf1两组分斑点的分离度 R*-相邻两组分斑点的分离度 SV的含义:在Rf=0和Rf1两组分斑点间能容纳分离度R*的相邻组分的斑点数。,39,例1 若Rf=0及Rf1两组分斑点分离度R=6,两相邻组分斑点的R*=1.5,则:,说明在薄层板上Rf=0及Rf1两组分斑点间能容纳R*=1.5的斑点3个。,40,例2 若Rf=0及Rf1两组分斑点分离度R=6,两相邻组分斑点的R*=1.0,则:,说明在薄层板上Rf=0及Rf1两组分斑点间能容纳R*=1.0的斑点5个。,41,SV的数值取决于R和R*,无统一规定,所以不便

9、于比较,所以,常用分离数(SN或TZ)衡量色谱柱和薄层的分离性能。,42,(四)分离数(separation number,SN; Trennzahl,TZ),在柱色谱法中的定义和含义,43,44,将分离度公式代入上式:,45,分离数的含义:,当相邻峰的分离度(R*)为1.177时,在含有Z与Z+1个碳同系物间能容纳的色谱峰数。 用例1中的正戊醇与正己醇的数据计算SN得:,46,计算结果表明,该WCOT柱在正戊醇与正己醇间可容纳相邻峰分离度为1.177得色谱峰26.5个。,47,2.在薄层色谱法中的定义和含义,48,在薄层色谱法中,计算Rf=0及Rf=1两组分斑点的分离度时,可用下式:,49,

10、SN的含义:,在相邻斑点的分离度为1.177时,在Rf=1及Rf=0两组分斑点间能容纳的斑点数。,50,计算结果表明,在Rf=1及Rf=0的组分的斑点间,可容纳相邻斑点的分离度(R*)为1.5得斑点9.5个。,例 用硅胶板,在一定的分离条件下,得 以下数据:L=127mm,Rf=0物质的b0=3.9mm,Rf=1物质的b1=8.2mm,计算SN=?,51,五、相平衡参数,(一) 分配系数 1.分配系数与线性色谱 (distribution coefficient;K) 组分在固定相 (s) 与流动相 (m) 中的浓度 (C) 之比。,52,分配系数与组分浓度大小无关,其色谱峰呈正态分布-线性色

11、谱。非线性色谱体系的K不是常数,K随浓度而变化。分配系数由组分和固定相的热力学性质决定,随柱温而变化,与两相体积无关。在液相色谱法中,还决定于流动相的性质。,53,2.分配系数与柱温的关系,Go- 相对于标准状态的组分自由能 R -气体常数 Tc -柱温 一般,温度上升20,K值约下降一半。,54,3容量因子(capacity factor;k) 组分在固定相和流动相中的质量(m)之比。,容量因子又称为质量分配系数或分配比。,55,Vm-色谱柱中流动相的体积, 近似等于死体积V0Vs-柱中固定相的体积,56,(二) 分配系数和容量因子与保留时间的关系设流动相的线速度为u,组分的速度为v,将二者

12、之比称为保留比:,4分配系数和容量因子的关系,57,在定距展开如柱色谱中,v=L/tR,u=L/t0,因此,58,59,60,(三)分配系数与保留体积的关系,61,(四)分配系数与比移值的关系,62,(五)容量因子与比移值的关系,63,例1 组分A在柱内的移动速度只 有流动相速度的1/10,柱内液体 流动相体积为2.0ml,固定相体 积为0.5ml。求流动相流量为 10ml/min时,组分A停留在固定 相中的时间和它的分配系数。,64,R=1/1+k = 0.1 k = 9 VR=Vm(1+k)=2.0(1+9)=20ml tR=VR/F0=20/10=2.0min t0=tR/1+k=2.0

13、/1+9=0.2min,65,组分停留在固定相中的时间为:,66,例2 组分A和B分别在15.0min和25.0min洗脱出柱,而非滞留组分只需2.0min。 求:1)B对A的相对保留时间2)A的容量因子3)A滞留在流动相中的时间 分数,67,A滞留在流动相中的时间分数,即为保留比,68,六、色谱分离的前提,69,两式相减得:,70,第二节 塔板理论,塔板理论假定: 在色谱柱内一小段长度H内,组分可以在两相中瞬间达到分配平衡。H称为理论塔板高度 。 流动相进入色谱柱不是连续的,而是间歇式的,每次进入一个塔板体积。,71,试样和新鲜流动相都加在第0号塔板上,且试样的纵向扩散可以忽略。 分配系数在

14、各塔板上是常数。,72,一、二项式分布,假设:分离含有2个组分的混合物 K= Cs / Cm = 2 Vs = Vm 试样溶液100%加到零号塔板上 上层(流动相溶质含量):mm 下层(固定相溶质含量):msmm + ms = 1,73,经过N次转移后,在各塔板内组分的质量分布符合二项式的展开式: (mm + ms)N = 1 N=3,K=2时,mm=0.333,ms=0.667, 各塔板内溶质的含量为: (0.667+0.333)3 = 0.297 + 0.444 + 0.222 + 0.037(0号)(1号)(2号) (3号),74,75,转移N次后第r号塔板中的质量Nmr,例如,N=3,

15、r=3时,即转移3次后,在第3号塔板内的溶质分数为:,76,二项式展开式各项相当于各塔板中某一个组分溶质的总量,组分在流动相中的含量应为:,77,78,组分在固定相中的含量应为:,79,当 n=3, r=0时, 求流动相和固定相中溶质的含量,80,二、正态分布, -标准差 tR-保留时间 C0为峰面积A,即相当于某组分的总量 C -任意时间t时的浓度,色谱流出曲线方程式:,81,(1) t = tR时,有极大值 ,Cmax即流出曲线的峰高,也可用h表示。 将h及W1/2=2.355代入上式 ,得峰面积C0或A:A=1.065W1/2h,讨论,82,将式 (2) 代入式 (1) 得:,不论 t tR或 t tR时,浓度C恒小于Cmax。 C随时间t向峰两侧对称下降。,83,三、理论塔板高度和理论塔板数,84,H =L/n 如果用 代替tR,为有效塔板数:,理论塔板高度为:,85,例1 在柱长2m、5%阿皮松 柱、柱温100、记录纸速为 2.0cm/min的实验条件下,测定 苯的保留时间为1.50min,半峰 宽为0.10cm。求理论塔板高度 和每米的理论塔板数。,86,每米理论塔板数为:2.4103/2=1.2103(m1),

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