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1、实验十一 细菌的药敏实验及耐药表型检测,实 验 目 的,一种抗生素如果以很小的剂量便可抑制、杀灭致病菌，则称该种致病菌对该抗生素“敏感”。反之，则称为“不敏感”或“耐药”。为了解致病菌对哪种抗菌素敏感，以合理用药，减少盲目性，往往应进行药敏试验。,实 验 方 法,药物敏感试验,目前常用的药敏试验方法有：纸片琼脂扩散法（K-B法）、稀释法、E试验、检测细菌耐药性的方法。稀释法分液体稀释法和琼脂稀释法。检测细菌耐药性的方法包括 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的检测、耐万古霉素肠球菌（VER）的检测、耐青霉素肺炎链球菌（PRP）的检测、超广谱 -内酰胺酶（ESBL）的检测和-内酰胺酶的检测。,
2、药物敏感试验,药敏试验方法 纸片琼脂扩散法（K-B法）、稀释法 稀释法分液体稀释法和琼脂稀释法。检测细菌耐药性的方法 超广谱 -内酰胺酶（ESBL）的检测 -内酰胺酶的检测,-药敏实验,实 验 方 法,平板扩散法,1 可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌 混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密 2 将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般每个平皿贴4片，每种药敏片的名称要记住。 3将平皿培养基置于37温箱中培养24小时
3、后，观察效果。,平板扩散法,4 抑菌环直径测量：以肉眼观察没有明显菌苔生长的边缘为界，用的卡尺量取抑菌环直径。变形杆菌在抑菌环内生长的薄菌苔可忽略不计。复方新诺明抑菌环内会有轻微细菌生长，小于20左右可忽略不计。 5 结果报告：，抑菌环直径的大小可以反应MIC值的高低。因此根据抑菌环直径的大小可以参照稀释法MIC值的判断标准报告敏感、耐药和中介。,常量肉汤稀释法,1.抗菌药物贮存液制备 抗菌药物贮存液浓度不应低于1000g/ml(如1280g/ml)或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。抗菌药物直接购自厂商或相关机构。,常量肉汤稀释法,2.药敏试验用抗菌药物浓度范围 根据
4、NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。 3. 培养基 NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.27.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。,常量肉汤稀释法,4.接种物的制备 直接菌落悬液配制法，直接取培养1824h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物。 E、附：0.5麦氏比浊管配制方法 0.048M BaCL
5、2 (1.17% W/V BaCL2 . 2H2O) 0.5ml 0.36N H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml 将二液混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。用前混匀。 有效期为6个月。 F、稀释抗菌药物的制备及菌液接种 1.1.5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种 取无菌试管（13100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如1280g/ml） 0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度
6、依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25g/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125g/ml。 G、孵育 1.1.6.孵育 将接种好的稀释管塞好塞子，置35普通空气孵箱中孵育1620h；嗜血杆菌和链球菌在普通空气孵箱中孵育2024h；对可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌应持续孵育满24h。 H、结果判断与解释 1.1.7.结果判断与解释 在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否
7、良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法终点判断，与阳性生长对照管比较抑制80%细菌生长管药物浓度为受试菌MIC。,在临床微生物学检验中，麦氏比浊法常用于细菌鉴定、药敏实验前配置菌液时大致判断菌液浓度的一种方法，通常认为，如将配菌液浓度配成0.5麦氏比浊管时，相当于1.5108细菌数/ml，由于方法本身就是一种估计的方法，所以尽管不同细菌大小差异很大，除了真菌孢子，细菌的差别不大，结果不会有影响。但是，标准比浊管的浓度，是药敏实验结果的影响因素之一。
8、,常量肉汤稀释法,5. 稀释抗菌药物的制备及菌液接种 取无菌试管（13100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如1280g/ml） 0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25g/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32
9、、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125g/ml。,常量肉汤稀释法,6.孵育 将接种好的稀释管塞好塞子，置35普通空气孵箱中孵育1620h；嗜血杆菌和链球菌在普通空气孵箱中孵育2024h；对可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌应持续孵育满24h。,常量肉汤稀释法,7.结果判断与解释 在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法终点判断，与阳性生长对照管比较抑制80%细菌生
10、长管药物浓度为受试菌MIC。,琼脂稀释法,介绍 琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至50左右的定量MH琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。,琼脂稀释法,培养基制备 2.1.培养基制备 使用MH琼脂，按商品说明书进行配制，pH7.27.4。淋病奈瑟菌使用GC琼脂基础加1%添加剂；其它链球菌使用含5%（V/V）绵羊血的MH琼脂（当试验磺胺药时，使用溶解的马血）。,2.2.含药琼脂平板制备 根据
11、实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在4550水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度34mm。通常按19比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置28冰箱可贮存5天。,琼脂稀释法,2.3.接种物制备与接种 制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再110稀释，以多点接种器吸取制备好菌液（约12l）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU，形成直径为58mm的菌斑。接种好后置35孵育1620h。,琼脂稀释法,2.4.结果判断 将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物
12、浓度为MIC。在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。,琼脂稀释法,2.4.结果判断 将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。,琼脂稀释法,-特殊耐药性检测,实 验 方 法,AmpC酶,AmpC 酶是AmpC内酰胺酶的简称。 是由肠杆菌科细菌或和绿脓假单胞菌的染色体或质粒介导产生的一类内酰胺酶,属内酰胺酶Ambler 分子结构分类法中的C 类和Bush Jacoby Medeiros 功能分类法中第一群，即作用于头孢菌素、且不被克拉维酸所抑制的内酰胺酶。故AmpC 酶又称作为头孢菌素酶。,棒酸,又称克拉维酸。 由棒酸链霉菌产生的一种-内酰胺酶抑制剂。 仅有微弱的抗菌活性，但可与-内酰胺酶牢固结合，生成不可逆的结合物，具有强力而广谱的抑制-内酰胺酶的作用，与-内酰胺类抗生素合用起协同作用。口服吸收良好单独应用无效，常与青霉素类药物合用治疗葡萄球菌属及革兰氏阴性菌所致的疾病。,实 验 结 果,1 药物敏感试验 - 影响药敏结果的因素 2 应用,讨 论,
