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1、PCR引物设计及相关软件使用,主要内容,背景 PCR引物设计原则 常用PCR引物设计软件 Oligo 7.0 介绍,PCR,聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。,PCR引物设计,引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩
2、增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。,引物设计的原则,引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。,如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用G 值反映)，形成引物二聚体
3、(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。,具体因素,一般原则,1.引物长度 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-24 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存
4、在200个潜在的退火位点(3 x 109/412=200 ).而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个.,Tm值的计算 一般的公式 Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 对于长一些的引物可用更为准确的 nearest-neighbor （Frier et al. (1986) ）,一般原则,2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。,一般原则,3，引物3端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不
5、同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。,一般原则,4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 不同的算法推荐45-55%或50-60%,一般原则,5. G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G 值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G 值相对较高的引物。引物的3端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结
6、构并引发DNA 聚合反应。（能值越高越容易结合）,一般原则,6. 对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。,一般原则,7. 引物二级结构对PCR反应的影响。 尽可能少的引物二聚体。,一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。 下面我们以克隆目的基因APP751 (aa18-285)为例，简单介绍一下使
7、用oligo 7.0如何设计产物序列固定的引物！,Oligo 7 使用说明,主要功能：专门的引物设计软件 “Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。,Oligo 7.0 启动界面,Open sequence file,用Oligo 设计引物时的3个标准,Tm 值曲线以选取5到3的下降形状有利于引物引发聚合反应。 Frq 曲线宜选用3端Frq 值相对较低的片段。 G 值在5端和中间值比较高，而在3端相对低,选择上游引物,上游引物,Select Forward Primer,选择下游引物,Select Reverse Primer,
8、下游引物,引物参数,引物参数,引物详细参数,Key information of primer,Dimer and cross Dimer,Hairpin,GC%,Total PCR information,引物分析,首先检查引物二聚体尤其是3端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。,引物分析,第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的
9、能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。当然，在设计克隆目的的PCR引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。,引物分析,第三项检查为GC含量，以45-55为宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果PCR的模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site的检测。这项检查可以看出引物在非目的位点
10、引发PCR反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高，就可能出假阳性的PCR结果。一般在错配引发效率以不超过100为好，但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。,Final PCR information,PCR产物,当我们结束以上四项检测，点击PCR产物，其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。,改变引物的长短,我们可以通过减少或增加引物的长短，比较不同引物的参数，选择一对参数较好的引物.,改变引物匹配模板的长短，重新选择上下游引物，分析引物参数,改变引物匹配模板的长短,编辑引物,编辑上下游引物,编辑引物,加限制性酶切位点及保护碱基、Tag,Online primer3 service,http:/frodo.wi.mit.edu/,
