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1、1,荧光定量PCR技术 及临床应用,三 九 集 团 第三军医大学基因诊断中心 卫国,2,荧光基因探针杂交定量PCR技术介绍,1985年美国PE-cetus公司的人类遗传研究室mullis等人发明了具有划时代意义的PCR技术，从而使人们梦寐以求的体外扩增核酸片段的愿望成为现实。 1987年该项技术获美国专利。 1988年PE-cetus公司推出了第一台PCR热循环仪，从而使PCR技术的自动化成为现实。 Mullis出因其卓越的贡献与寡核苷酸基因定点诱变的发明者Michael分享了1993年诺贝尔化学奖。 随着PCR技术的日臻成熟1995年出现荧光基因探针杂交定量PCR方法,3,传统的临床微生物检
2、测方法,细菌涂片 细菌培养 免疫学技术,分别存在检出率低、周期长、特异性差的缺点。,4,普通PCR临床检测技术的缺点,普通PCR临床检测技术虽然解决了检出率低、周期长的问题，但由于假阳性率高，不能正确指导临床实践。 因此国家卫生部曾在1997年行文禁止将普通PCR技术用于临床诊断。,5,FQ-PCR与普通PCR的区别,采用闭管检测，不需PCR后处理，并采用dUTP-UNG酶的防污染系统，扩增和检测一次同时完成。不需开盖，不产生污染。 避免了假阳性。探针与被检DNA序列特异杂交， 增强了特异性。,6,FQ-PCR与普通PCR的区别,可定量结果，准确灵敏地反应了病原体的感染和治疗恢复情况。光谱分析
3、仪直读结果，自动分析， 增强了灵敏性和客观性。,7,荧光基因探针杂交定量PCR技术,随着PCR技术的日臻成熟，已出现的荧光基因探针杂交定量PCR方法把目的基因扩增、特异分子杂交和荧光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行， 并通过微机控制，实现了对扩增产物进行实时 动态检测和结果的自动分析。,8,荧光基因探针杂交定量PCR技术,不仅进一步提高了特异性，并从根本上解决了PCR扩增产物污染的难题，保持了PCR技术的快速和高灵敏性，使假阳性率和假阴性率降低到最低限度，而且能定量被检微生物的核酸拷贝数，为临床实践提供准确的病原微生物的诊断、提供评估药物临床治疗效果的可靠依据
4、。 因此，荧光基因探针杂交定量PCR技术诊断病原微生物与迄今本院各临床科室所进行的临床检测技术不相重复，它是一种属不同层次、快速、准确、直接并具有不同临床指导意义的检测方法。,9,荧光定量聚合酶链反应 （FQ-PCRFluorescence quantitative PCR）,一种完全闭管式的PCR和荧光探针杂交技术相结合的定量PCR方法PCR的高效扩增特性核酸探针的高特异性光谱技术的高灵敏性和可计量性,10,荧光基因探针杂交定量 PCR技术与临床,在确保特异性的前题下，高质的灵敏性使得PCR技术能探测到疾病发展的初期阶段，甚至于临床症状出现前或亚临床状态或机体正在向病态发展的早期过程之中，如
5、对于感染性疾病，以往的方法要么间接的检查机体免疫系统对侵入微生物的反应产物降解产物（如抗原）或直接检查侵入微生物（如培养，镜检），但上述方法的灵敏度都受到方法学上的限制而达不到检查极微量级（如Pg水平），因而难以在早期对疾病的发生做出准确，客观的诊断，但PCR巨大的放大效率却解决了这一问题。,11,荧光基因探针杂交定量 PCR技术与临床,另外如对像肿瘤等“渐变性”疾病是因多基因积累性突变才能造成正常细胞转变成癌细胞的，那么及时检测到突变由量变转化为质变前期阶段则显得极为重要，只有基因诊断才能完成这一目标。,12,荧光定量PCR检测的对象是致病的病因，所以对于鉴别疾病的致病因子非常实用和准确，这
6、对于区别相近临床症状的不同致病子，以期对因治疗极为有用。 荧光定量PCR可以对致病因子进行准确的定量，对治疗前后及治疗过程进行量化监控，则可以有效的观察药物治疗效果。 如果用致病子的数量多少表示治疗效果，则可以进行临床治疗方案的评价及治愈标准的确立。,13,荧光定量PCR检测的临床应用范围,用于疾病的早期诊断 用于疾病的鉴别诊断 用于疾病的病因确定 用于药物疗效的评价 用于治疗效果的评价 用于治愈标准的确定,14,荧光定量PCR技术应用于 感染性疾病的诊断,15,结核杆菌的临床诊断方法,目前结核病确诊主要依靠痰片染色，抗酸杆菌和结核杆菌的培养法鉴定。但涂片阳性率不高，且不能确诊；培养法需较长时
7、间。 ELISA和RIA法敏感性低，尚不能直接检测临床标本。 近年来国外出现了培养早期进行放射性检测的BacTec技术，能显著缩短报告时间，但价格极贵，国内很难推广。 基因诊断技术的应用是一大突破，其中包括基因探针技术，染色体指纹技术和荧光定量PCR技术。,16,.北京胸科医院;北京市结核病胸部肿瘤研究所;上海肺科医院三家医院的考核情况。三家医院标本分布医院 结核组351例 对照组160例 例数 涂阳 培阳 北京胸科 143 36 42 60 北京结研所 151 40 31 50 上海肺科 57 57 29 50,结核分枝杆菌(TB) FQ-PCR检测与常规检测比较,17,FQ-PCR法与涂片
8、法、培养法的检出率比较,组别 涂片法 培养法 FQ-PCR法 例数 阳性 检出率 阳性 检出率 阳性 检出率 结核病组 351 133 37.9% 102 29.1% 220 62.7%对照组 160 0 0% 0 0 % 0 0 %,18,荧光定量PCR技术 检测结核杆菌应用评价,1. 特异性 人型结核杆菌，牛型结核杆菌及卡介菌均可扩增检测出，其它分支杆菌均否。 2. 敏感性 可检测1pg DNA，其相当于30个结核杆菌的染色体DNA量。 3. 临床应用 快速 可检测无法培养的结核杆菌,19,临床上，结核性脑膜炎是小儿多发病，病情凶险，所以早期快速诊断具有重要意义，而荧光定量PCR方法整个过
9、程才45小时，远较细胞培养法为快，而且准确。检测标本无特殊限制：痰、尿、腹水、胸水、关节液、血、肺泡灌洗液、脑脊液、分泌物等均可送检,20,荧光定量PCR检测淋球菌,淋病的临床表现缺乏特异性，其确诊主要是进行实验室检查。传统的方法有涂片染色法，分离培养法和用来检测淋球菌抗原的EIA-Gonozyme系统法。近年来，荧光定量PCR诊断技术的应用，使淋病的快速诊断有重大突破。荧光定量PCR方法适用于淋病的快速诊断和流行病学调查。,21,乙型、丙型肝炎病毒的PCR检测,22,HBV感染的诊断主要采用免疫测定法检测血清标本中的HBSAg，HbeAg，抗-Hbs，抗-HBc和抗-Hbe（两对半），免疫学
10、方法虽然比较简单，但只能提供血清中的HBV间接证据，无法证明是否具有传染性，而且敏感性较低。而内源性DNA聚合酶法和斑点杂交分析法则可直接确定临床标本中HBV DNA的存在。尽管比较敏感，但只能检测到0.1pg的HBV DNA。而荧光定量PCR方法则可检测到200copy/ml的HBV DNA，因而是极为有用的方法。,23,肝炎病毒的PCR检测的意义,PCR方法可检出杂交法测定阴性而具有不同HBV血清学标志的血清标本中的HBV DNA。 PCR方法可检出HBs Ag阳性而Hbe Ag阴性携带者的HBV DNA。 PCR方法可检出慢性HBV感染干扰素治疗后转阴的患者血清中残存的HBV DNA。,
11、24,丙型肝炎病毒的PCR检测,丙型肝炎多由输血或血液制备引起,临床预后较差,死亡率高, 所以早期诊断具有非常重要的意义. 目前最为敏感和特异的方法, 属荧光基因杂交定量PCR方法。,25,应用评价,PCR法是检测病毒血症(HCV RNA)的最敏感方法。 PCR方法克服了抗体测定法之不足,通过扩增核酸达到检测病毒的目的. PCR法可用来区分活动性HCV和急性期的消退性感染,后者与病毒RNA的消失有关。 血清转化期,PCR法也可检出HCV RNA存在。 对非甲非乙肝炎患者,PCR方法对肝活检组织HCV RNA有很高的检出率。,26,肝炎病毒的PCR检测的意义,HBV及HCV的PCR检测确诊对手术
12、相关科室待手术病人十分重要。明确术前病人是否具有传染性，对术中医务人员的自身保护、术后病人敷料及分泌物的正确处理以防止院内交叉感染，并避免因术前、术后诊断不明确引起的医疗纠纷都具有直接的指导意义。 因此，建议手术相关科室从以上诸方面考虑，常规进行HBV、HCV荧光基因杂交定量PCR检测。也建议其他科室对相关病人进行检测。,27,人类巨细胞病毒(HCMV)的PCR检测,巨细胞病毒(CMV)为疱疹病毒科成员，其基因组由一240kb的线性双股DNA分子组成，人类巨细胞病毒对人的感染很普遍，有时感染是致死性的。这种病毒也是引起人类先天性畸形的一个重要原因，所以建立快速敏感的诊断方法甚为重要。,28,一
13、、人类巨细胞病毒(HCMV)的诊断方法,快速细胞培养技术 LISA法 分子杂交法 PCR方法,29,快速细胞培养技术敏感性低。 ELISA法除敏感性不高外，还易受干扰因素的影响。 探针杂交检测DNA法，对标本的处理及制备较麻烦；而且只有当细胞中CMV的拷贝数很高时，该方法的敏感性才可提高。 随着对CMV基因组序列的阐明，PCR技术在CMV的检测方面已成为最准确的方法。,30,用PCR检测衣原体DNA,衣原体属包括3个种，分为： 沙眼衣原体 (引起眼部疾病和性传播疾病) 鹦鹉热衣原体 (引起呼吸道疾病) 肺炎衣原体 (引起肺炎),31,沙眼衣原体不仅可致眼部疾病，也是性传播疾病的主要病原体。 鹦
14、鹉热衣原体和肺炎衣原体在人类则主要引起呼吸道疾病。然而衣原体感染常缺乏特异症状，使临床诊断和监控甚为困难。选择衣原体保守的16SrRNA基因为模板，应用PCR技术则可以敏感，特异和简便地进行诊断。,32,应用前景,PCR技术适于： 沙眼衣原体生殖泌尿道感染的早期诊断，尤其适于对无症状携带者或轻症患者的诊断。 根据采集标本的部位不同，检测其它衣原体的感染。 作衣原体感染的分子流行病学调查.为性传播疾病的监控提供依据。,33,第三军医大学基因诊断中心,附属于西南医院综合实验研究中心，位于西南医院科教楼4楼是重庆市首家引进美国BIO-RAD 公司的“iCycler”荧光定量PCR检测仪和PE公司37
15、7型全自动DNA测序仪的实验室。能准确、及时地为临床在基因水平提供肝炎、性病、结核、HIV 等病原体感染 的定量分析及疗效评估。,34,第三军医大学基因诊断中心 现所开展的检测项目,乙肝病毒（HBV）荧光定量PCR检测 丙肝病毒（HCV）荧光定量PCR检测 淋球菌（NG）荧光定量PCR检测 沙眼衣原体（CT）荧光定量PCR检测 解脲支原体（UU）荧光定量PCR检测 结核分支杆菌（TB）荧光定量PCR检测,35,单纯疱疹病毒（HSV）荧光定量PCR检测 人类巨细胞病毒（CMV）荧光定量PCR检测 人乳头瘤病毒6 型（HPV 6型）荧光定量PCR检测 人乳头瘤病毒11型（HPV 11型）荧光定量PCR检测 人乳头瘤病毒16型（HPV 16型）荧光定量PCR检测 人乳头瘤病毒18型（HPV 18型）荧光定量PCR检测 梅毒螺旋体（TP）荧光定量PCR检测 肺炎支原体（MP）荧光定量PCR检测 EB病毒（EBV）荧光定量PCR检测,36,谢 谢!,01-3-30,
