第十五章 生物制品制造工艺

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1、,第十五章 生物制品制造工艺 第一节 生物制品的基本概念生物制品（biological product）是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。现代生物技术发展使生物制品在产品结构上发生了很大变化，极大地扩展了生物制品的研究内容。根据其所用材料、制法或用途，生物制品可以分为菌苗、疫苗、类毒素、抗血清与抗毒素、血液制品、细胞因子、重组DNA药物、核酸药物和诊断用品等。,一、生物制品的分类1、预防类制品（1）菌苗（bacterial vaccine） 由有关细菌、螺旋体或其衍

2、生物制成的减毒活菌苗、灭活菌苗、亚单位菌苗、基因工程菌苗等。（2）疫苗（vaccine） 由病毒、衣原体、立克次体或其衍生物制成的减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗等。（3）类毒素 由有关细菌产生的外毒素经脱毒后制成。常用的有白喉、破伤风、肉毒素及葡萄球菌类毒素等。,（4）混合制剂 由2种或2种以上疫苗、菌苗、抗原液配制成的具有多种免疫原性的灭活疫苗或活疫苗。2、治疗类生物制品 （1）免疫血清及抗毒素由特定抗原免疫动物，经采血、分离血浆或血清，而后精制而成。抗细菌和病毒的称抗血清，抗蛇毒和其他毒液的称抗毒血清，这两者统称为免疫血清；抗微生物毒素的称抗毒素。（2）血液制品（blood

3、 products） 由健康人的血浆或特异免疫人血浆分离、提纯或由重组DNA技术制成的血浆蛋白组分或血细胞组分制品，可用于诊断、治疗或被动免疫预防。,（3）细胞因子 细胞因子或称为细胞生长调节因子，系在体内和体外对效应细胞的生长、增殖和分化起调控作用的一类物质。（4）重组DNA产品 重组DNA产品是指利用重组DNA技术制备的生物制品。有重组激素类药物，重组疫苗。3、诊断类制品 （1）体外诊断制品 由特定抗原、抗体或有关生物物质制成的免疫诊断试剂或诊断试剂盒，用于体外免疫诊断。,（2）体内诊断制品 由变态反应原或有关抗原材料制成的免疫诊断试剂，用于皮内接种，以判断个体对病原的易感性或免疫状态。用

4、于体内免疫诊断。 4、其他制品由有关生物材料或特定方法制成，不属于上述几类的其他生物制剂，用于治疗或预防疾病。如治疗用型肉毒素制剂、微生态制剂、核酸制剂等。,二、生物制品的质量要求生物制品必须强调质量第一的原则。质量好的生物制品必须具备两个重要条件：安全和有效。生物制品的质量要求：世界卫生组织要求各国生产的制品必须有专门检定机构负责成品的质量检定，检定部门要有熟练的高级技术人员，精良的设备条件，以保证检定工作的质量。未经专门检定部门正式发给检定合格的制品，不准出品使用。检定包括安全性和效力检定两方面，前者包括 毒性试验； 防腐性试验；热原质试验；,安全试验；有关安全性的特殊试验 等5项，后者包

5、括 浓度测定（含菌数或纯化抗原量）； 活菌率或病毒滴度测定； 动物保护率试验； 免疫抗体滴度测定； 稳定性试验 等5项。国内新的制品在正式出品前，要按新生物制品规程报卫生部审批，要求先进行小量人体观察，并做出免疫学及流行病学效果评价。没有科学数据证明安全、有效的制品，不能大量生产使用。,第二节 疫苗和菌苗一、概述疫苗和菌苗在人类防治疾病上发挥了重要作用。30年来，随着分子生物学、分子免疫学、蛋白化学等的发展，疫苗研究已进入到使用现代生物技术进行新型疫苗研究的阶段。,二、疫苗、菌苗的种类与发展随着分子生物学、分子免疫学等发展及现代生物技术在新疫苗研制中的应用，新型疫苗以基因工程疫苗为主体，包括基

6、因工程疫苗、合成肽疫苗、遗传重组疫苗、抗独特型抗体疫苗等。 1、常规疫苗常规疫苗有活疫苗和死疫苗两类：活疫苗是指用人工定向变异的方法或从自然界筛选出来的毒力高度减弱或基本无毒的活的微生物制成的预防制剂。,死疫苗是指用物理或化学方法杀死或灭活培养增殖的标准微生物株制成的预防制剂。其免疫效果较活疫苗差，且不持久，但较活疫苗安全。,2、亚单位疫苗设法除去病原体中对激发保护性免疫无用的甚至有害的成分，保留其有效的免疫原成分，所制成的疫苗称亚单位疫苗。亚单位疫苗具有较高的安全性，但其免疫效果一般较差。 3、基因工程疫苗基因工程疫苗 是指用重组DNA技术克隆并表达保护性抗原基因，利用表达的抗原产物或重组体

7、本身制成的疫苗。主要包括基因工程亚单位疫苗、基因工程载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗及蛋白工程疫苗等。,4、合成肽疫苗合成肽疫苗 是指用化学方法合成能够诱发机体产生免疫保护的多肽制成的疫苗。5、遗传重组疫苗遗传重组疫苗 是指使用经遗传重组方法获得的重组微生物制成的疫苗。通常是将对人体无致病性的弱毒株与强毒株混合感染，筛选具有野毒株强免疫同时对人体不致病的重组菌株。,6、抗独特型抗体疫苗抗独特型抗体疫苗 是指使用与特定抗原的免疫原性相近的抗抗体做抗原制成的疫苗。 三、疫苗的制造方法不同疫苗的制备方法各异，图151为一般疫苗的制备工艺流程。,(一)、毒种的选择和减毒用于制备疫苗的毒株，一般需具备

8、以下几个条件，才能获得安全有效的疫苗。 （1）毒种必须持有特定的抗原性，能使机体诱发特定的免疫力，足以阻止有关的病原体的入侵或防止机体发生相应的疾病。 （2）毒种应有典型的形态和感染特定组织的特性，并在传代的过程中，能长期保持生物学特性。,（3）毒种易在特定的组织中大量繁殖。 （4）毒种在人工繁殖的过程中，不应产生神经毒素或能引起机体损害的其他毒素。 （5）如系制备活疫苗，毒种在人工繁殖的过程中应无恢复原致病力的现象，以免在疫苗的使用时，机体发生相应的疾病。 （6）毒株在分离时和形成毒种的全过程中应不被其他病毒所污染。用于制备活疫苗的毒种，往往需要在特定的条件下将毒株经过长达数十次或上百次的传

9、代，降低其毒力，直至无临床致病性，才能用于生产。,（二）、病毒的繁殖所有动物病毒，只能在活细胞中繁殖。在通常的情况下，病毒可用下列几种方法繁殖。 （1）动物培养 这种方法是将病毒接种动物的鼻腔、腹腔、脑腔或皮下，使之在相应的细胞内繁殖。接种动物的种类、年龄和接种途径依病毒的种类而异。这种繁殖方法的缺点是动物饲养管理麻烦和具有潜在病毒传播的危险，故在生产中已逐渐被淘汰。,（2）鸡胚培养 这种方法是将病毒接种到714d龄鸡胚的尿囊腔、卵黄囊或绒毛尿囊膜等处；接种的部位亦因病毒种类的不同各异。 （3）组织培养 从20世纪50年代开始，组织培养已广泛用于病毒培养。目前，差不多所有人类和动物的组织都能在

10、试管中培养。 （4）细胞培养 用于疫苗生产的主要有原代细胞培养和传代细胞培养两种方法。这些细胞经过长期传代，有可能失去正常细胞的某些特性，染色体将成为异倍体或不成倍数，亦且成为恶性细胞，故用它们生产疫苗时，传代的次数应控制在一定的范围内。,（三）疫苗的灭活不同的疫苗，其灭活的方法不同，有的用甲醛溶液，有的则用酚溶液。所用灭活剂浓度则与疫苗中所含的动物组织量有关。灭活温度和时间，需视病毒的生物学性质和热稳定性质而定。其原则是要以足够高的温度和足够长的时间破坏疫苗的毒力，而以尽可能的最低温度和最短时间来尽量减少疫苗免疫力的损失。往往是通过试验选取最适的灭活温度和时间来解决。,（四）疫苗的纯化疫苗纯

11、化的目的，是去除存在的动物组织，降低疫苗接种后可能引起的不良反应。但在细胞培养的过程中，得用换液的方法除去培养基中的牛血清。用动物组织所制成的疫苗，经过纯化，不能达到完全消除不良反应的目的，故这种疫苗已被逐渐淘汰，以细胞培养的疫苗取代。 （五）冻干这样的疫苗将能保持良好的稳定性。,四、菌苗类制品和类毒素的制造方法菌苗类制品和类毒素的制备，均由细菌培养开始，图15 2概括了一般菌苗和类毒素制备的工艺流程：,1、菌种的选择用于菌苗的菌种，一般须具备以下几个条件，才能制成安全有效的疫苗。 （1）菌种必需持有特定的抗原性，能使机体诱发特定的免疫力，足以阻止有关病原体的入侵或防止机体发生相应的疾病。 （

12、2）菌种应具有典型的形态、培养特性和生化特性，并在传代的过程中，能长期保持这些特性。,（3）菌种应易于在人工培养基上培养。 （4）如系制备死菌菌苗，菌种在培养过程中应产生较小的毒性。 （5）如系制备活菌苗，菌种在培养过程中应无恢复原毒性的现象，以免在菌苗使用时，机体发生相应的疾病。 （6）如系制备类毒素，则菌种在培养的过程中应能产生大量的典型毒素。总之，制备菌苗和类毒素的菌种，应该是生物学特性稳定，能导致获得副作用小、安全性好和效力高产品的菌种。,五、疫苗（菌苗）类生物制品的质量检定 （一）理化性质检定 1、物理性状的检查包括外观、真空度、装量、溶解速度检查等。 2、蛋白质含量测定有些制品如血

13、液制剂、抗毒素和纯化菌苗，需要测定其蛋白质含量。 3、纯度检查及鉴别试验血液制品、抗毒素和类毒素等制品，需要进行纯度检查或做鉴别试验。,4、分子量或分子大小测定提纯的蛋白质制品，在必要时需测定其单体或裂解片段的分子量及分子的大小；提纯的多糖体菌苗需测定多糖体的分子大小及其相对含量，常用的方法有凝胶层析法、SDS PAGE法和超速离心分析法。 5、防腐剂含量测定生物制品在制造过程中，为了脱毒、灭活或防止杂菌污染，常加入苯酚、甲醛、三氯甲烷、硫柳汞等试剂作为防腐剂或灭活剂。规程中对于各种防腐剂的含量都要求控制在一定的限度以下，防腐剂的含量过高能引起制品有效成分的破坏，注射时也易引起疼痛等不良反应。

14、,（二）安全试验预防或治疗用生物制品，在生产过程中须进行安全性方面的系统检查一般要求抓好以下3个方面。一是菌毒种或主要原材料的检查。二是半成品（包括原液）的检查。三是成品检查，按各项制品的不同要求，进行无菌试验、纯菌试验、毒性试验、过敏性试验、热原质试验及安全试验（指某制品的单项试验）等。为了保证使用安全，所有生物制品、血液制品，都必须逐批进行检查。安全试验包括以下4个方面的内容。,1、外源性污染的检查除无菌与纯菌试验外，还需进行以下项目的检查。 （1）野毒检查： （2）热原质试验：按照国内外药典和生物制品规程的规定，以家兔试验法作为检查热原的基准方法。,2、杀菌、灭活和脱毒情况的检查需做以下

15、3项试验。 （1）无菌试验 目的主要是检查有无本菌生长。 （2）活毒检查 主要是检查灭活疫苗。 （3）解毒试验 主要用于检查类毒素等需要脱毒的制品。,3、残余毒力和毒性物质的检查 （1）残余毒力试验 用作活菌苗及活疫苗检定。 （2）无毒性试验（一般安全试验） 。 （3）毒性试验 死菌苗、经杀菌、灭活后，其本身可能仍具有毒性。 （4）防腐剂试验 除用化学方法作定量测定外，还应做动物试验。,4、过敏性物质的检查 （1）过敏性试验（变态反应试验） 一般采用豚鼠试验。 （2）牛血清含量的测定 由于牛血清是一种异体蛋白，如制品中残留量偏高，多次使用能引起机体变态反应。 （3）血型物质的检测 对这类制品应

16、检测血型物质，并应规定其限量。,（三）效力试验生物制品的效力，从实验室检定来讲，一是指制品中有效成分的含量水平，二是指制品在机体中建立自动免疫或被动免疫后所引起的抗感染作用的能力。效力试验包括以下5个方面的内容。 1、免疫力试验将制品对动物进行自动（或被动）免疫后，用活菌、活毒或毒素攻击，从而判定制品的保护力水平。 （l）定量免疫定量攻击法 该法多用于活菌苗和类毒素的效力检定。,（2）变量免疫定手攻击法 （3）定量免疫变量攻击法 。 （4）被动保护力测定 先从其他免疫机体（如人体）获得某制品的相应抗血清，用以注射动物，待一至数日后，用相应的毒苗或活毒攻击，观察血清抗体的被动免疫所引起的保护作用。,2、活菌数和活病毒滴度测定 （1）活菌数（率）测定 以制品中抗原菌的活存数（率）表示其效力。 （2）活病毒滴度测定 活疫苗（如麻疹疫苗、流感活疫苗）多以病毒滴度表示其效力。 3、类毒素和抗毒素的单位测定 （1）絮状单位测定 能和一个单位抗毒素首先发生絮状沉淀反应的（类）毒素量，即为一个絮状单位。此单位数常用以表示类毒素或毒素的效价。 （2）结合单位（BU）测定 能与0.01单位抗毒素相中和的最小类毒素量称为一个结合单位。常用以表示破伤风类毒素的效价。,