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1、1,第五章 生物制品生产,2,主要内容,第一节 细胞大规模培养 第二节 动物细胞制药 第三节 植物次生代谢产物的生产,3,第一节 细胞大规模培养,大规模培养技术是建立在实验室培养方法（贴壁培养法和悬浮培养法）的基础上，再利用固定化细胞、人工灌注、生物反应器技术等技术发展起来的。一、细胞培养的操作方式 二、大规模细胞培养系统,4,一、细胞培养的操作方式,培养方式分为：分批式流加式培养半连续式连续灌注式,5,1、分批式培养,指先将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养，细胞不断生长，产物不断形成，经一段时间后，终止培养。,6,分批式培养特点,系统密闭，只允许气体和挥发性代谢物质与外界交换。 培养基
2、体积固定，当主要营养物质耗尽时，细胞即停止生长，又称为分批培养或间歇培养，多在3-5d/批。 细胞数目、总重量、DNA含量呈“S”形(五个时期)变化。 为保证细胞不断增殖，须在达到最大重量时取出1/51/3的培养液，转移继代培养。 是传统的、常用的方法，可直接放大。其工业反应器规模可达 12000L。,7,8,2、半连续式（流加式）培养,指在分批式培养的基础上，将分批培养的培养液部分取出，并补充加入等量的新鲜培养基，使反应器内培养液的总体积保持不变。,9,3、流加式培养,在分批式操作的基础上，在培养过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的营养物或培养基，从而使细胞持续生长至较高的密
3、度，目标产品达到较高的水平。 由于流加式培养能控制更多的环境参数，使得细胞生长和产物生成容易维持在优化状态，是当前动物细胞培养工艺中占有主流优势的培养工艺。,10,4、连续灌注式培养,是把细胞接种后进行培养，新鲜的培养液不断从反应器一头加入，从另一头不断取出等量的培养液，细胞仍留在反应器内，使细胞处于一种营养不断供应状态。使反应条件处于一种恒定状态。,11,连续灌注式培养特点,1）不断加入新培养基，保证了营养物质的充分供应。 2）培养期细胞增殖速度快，细胞生长速率长久地保持在对数生长期，形成一个稳定的培养状态。 3）适用于细胞大规模工业化培养。 4） 由于连续培养需要的设备比较复杂，投入较大，
4、且要维持细胞无菌状态，技术条件要求苛刻，因此未得到广泛应用。,12,13,开放式连续培养-细胞随排出培养液一起流出且速度恒定。在稳定状态下流出细胞的速率等于培养系统中新细胞的增长速率。 封闭式连续培养-新鲜培养液和老培养液以等量方式进出，而收集的细胞重新放入原培养系统中继续培养，故培养系统中细胞数量是在不断增加的。,14,15,二、大规模细胞培养方法,按供养方式分为三种：搅拌式、气升式、旋转式 按细胞固定分为四种：悬浮培养、微载体培养、微囊化培养、微导管培养（中空纤维培养）。,16,机械搅拌式(Spinner),机械搅拌式主要是通过不锈钢搅拌系统使培养物的混匀。在罐体顶端有一些传感器，监测培养
5、物的温度、pH值、溶氧度(DO)、葡萄糖消耗、NH3、NH4+等参数。这种反应器培养规模可达2 000 L。,17,该系统优点： （1）设计简单，操作方便，易于放大生产； （2）细胞密度高，达到107/mL以上； （3）便于无菌操作，不易污染； （4）氧的转换率高，能满足细胞在生长时所需的要求。 缺点：对细胞损伤较大，产物含量不高。,18,气升搅拌式,气体从罐底的喷射管进入反应器的导流管。湍流温和而均匀，循环量大，细胞与培养液混合均匀。剪切力小，细胞的伤害小。喷射供氧，氧传递速率高，供氧良好。适用于悬浮细胞分批培养、微载体和连续培养。,19,工作原理反应器运转时，圆筒以30-60 r/min的
6、速度转动，由于离心力的作用，搅拌器中心管内产生负压，使搅拌器外培养基流入中心管，沿管螺旋上升，再从导流筒口排出，从搅拌器外沿下降，形成循环流动。在气腔内气体由分布管鼓泡，气体溶于液体中，依靠气腔丝网外液体的循环流动及扩散作用，使溶于液体中的气体成分均匀地分布到反应器内。,20,Celltech公司采用气升式反应器培养杂交瘤细胞，生产单克隆抗体。生产周期为14400h。从10L逐级放大到10000L。17d生产抗体100g，抗体合成大多数处于稳定期和衰退期，比传统摇瓶提高约5倍。,21,通气搅拌式细胞培养反应器,22,23,24,旋转式细胞培养系统,20世纪90年代中期，美国宇航局开发一系列旋转
7、式细胞培养系统(The rotary cell culture system, RCCS)，又叫回转式生物反应器(Rotatingwall vessel biore-actor, RWVB)。 RCCS是绕水平轴旋转、无气泡、膜扩散式气体交换的培养系统。,25,该反应器是将细胞种植到微载体后，将其移入RCCS圆柱状的培养容器内，加满培养液。整个容器由电机驱动沿水平轴旋转，细胞微载体颗粒在水平轴内建立均质的液体悬浮轨道，并随容器一起旋转且不与容器壁和其它物体相撞。细胞通过膜式气体交换器来吸氧和排出CO2。 由于系统无推进器、气泡或搅拌器,使破坏性应力减到最小。因此，细胞可以在相对温和的环境中进行
8、三维生长，得到类似人体内的培养产物. 近年来已经广泛应用于微载体系统，至今已有近百种组织细胞均在该系统内成功进行了大规模扩增。,26,27,悬浮培养,与微生物的肉汤培养基本相同。 悬浮培养细胞增殖快、产量高，没有接触抑制特性，是动物大规模培养的理想方法。 但只有极少数动物细胞适宜进行悬浮培养，适用于确立细胞株（系）、杂交瘤细胞、肿瘤细胞、血液和淋巴细胞培养。,28,微载体培养,微载体为三维培养系统，细胞贴附于微载体上伸展和增殖，微载体悬浮于培养液中。 微载体培养具贴壁和悬浮培养的双重优点，有很大的比表面积，供单层细胞贴附和增殖。 悬浮微球使细胞生长的环境均一，培养基利用率高，重复性好，容易放大
9、。 20世纪80年代正式用于工业化生产干扰素、疫苗和尿激酶原等。,29,理想的微载体所具备的性能： 质地柔软，微球间摩擦轻； 耐高温，可高压灭菌； 透明性，便于观察细胞生长； 细胞相容性，利于贴附和生长； 无毒性和惰性，对细胞无毒害，不产生有害物质，不吸附培养基； 低速即悬浮，静止即沉降，便于换液和收获； 微粒大小均匀；可回收重复使用。,30,为了提高贴壁能力，对基质表面进行包埋，如血清蛋白、多聚赖氨酸处理，可加速贴壁过程。悬浮培养早期，还可向培养液补充丙酮酸、腺嘌呤、次黄嘌呤、胸腺嘧啶等。 将这些微载体悬浮在培养液中，大大增加细胞的贴壁面积，可使每毫升培养基达到1000万个（108）细胞的密
10、度。,31,常用微载体,玻璃珠：直径约23 m，密度1.5 g/cm3。在玻璃表面覆盖塑料或中空玻璃也可达到此密度。 葡聚糖微载体：带正电，干粉在pH7.2的磷酸盐缓冲液中吸胀，清洗灭菌后使用。 Cytodex 2：电荷性大大下降，吸附能力很低，适合于蛋白质药物的生产。 纤维素微载体DE52和DE53：适合多种细胞培养。 聚丙烯酰胺载体：贴壁较快，亲水性。,32,多孔微载体：直径0.25 mm，孔径20300 m，达占总体积的85%，极大地增加了比表面积，可实现细胞的固定化，达到高密度培养。广泛使用的有：Cellsnow、Cytocell（纤维素基质）、Verax、Cultisphere（胶原
11、）、Cytoline 1和2（聚苯乙烯）、ImmobaSil（硅橡胶）及Siran（玻璃）等。主要用于搅拌、固定床和流化床反应器。,33,34,微囊化培养,利用固定化细胞技术，将一定量细胞与约4的褐藻酸钠混合后，滴到CaCl2溶液中，构成半透性微胶囊。又称固定化细胞、大载体培养法。,35,1） 细胞在微胶囊内生长，既吸收外界营养，又可排出自身代谢物。 2）细胞所受的剪切力损伤小， 细胞生长良好，纯度提高。便于连续培养，提高培养细胞的利用率； 3）细胞培养密度高，生长缓慢，有利于次生代谢产物的积累，提高产量。,36,4）次生代谢物直接分泌到培养液中，可简化分离、收获步骤，提高工作效率。如次生代谢
12、物不分泌， 培养结束后，收获微囊，破微囊，纯化抗体。 5）固定化细胞的氧气、营养供应与传递及细胞的遗传稳定性等问题有待于进一步研究解决。这种培养方法是生产单克隆抗体、干扰素的一种有效培养方法。目前，美国药用产品大规模生产常用此法进行。,37,38,39,中空纤维（微导管）培养,是模拟体内细胞三维生长环境而发明的。 将由硝酸纤维素或醋酸纤维素构成外径不超过1mm（1mm）的微导管平铺成层，相当于体内的毛细血管。微导管表面贴壁生长细胞，管内通无菌空气，管外浸泡在培养液中，气体、水分及其它营养物质可以通过微导管与细胞进行交换。 微导管表面的细胞密度可达100万/cm2个。细胞密度可达108/mL。,
13、40,培养基分散后,灌入床层。纤维管壁薄，半透膜，截留不同分子量。 纤维管的空腔组成的内室：灌流含氧气的培养基 纤维管之间的空间组成的外室：细胞生长。,41,细胞分泌的产物和血清中的成分由于分子量较大而无法进入内室，产物只能在外室积累和浓缩。细胞代谢的废物是小分子物质，可渗透进入内室，从内腔开口排出，避免了对细胞的毒性。在收获时，打开纤维管之间的外室开口，产物就流出来。此时虽然细胞停止分裂，但细胞的存活、健康和核形态不变，代谢和分化功能仍可保持数月。,42,第二节 动物细胞生物制药,用动物细胞的培养技术来生产有功能的蛋白质，特别是人源细胞的培养，在药物生产中的位置越来越重要。 一、表达蛋白的宿
14、主系统 二、生产用动物细胞的要求 三、常用动物细胞的特性 四、基因工程细胞构建和筛选 五、细胞库的建立,43,常见的动物细胞培养产物,44,基因工程药物生产示意图,45,一、表达目的蛋白的宿主系统,总体分为：原核表达系统和真核表达系统。 常见的宿主系统细菌、酵母、霉菌、丝状真菌、植物细胞、哺乳动物细胞等。,46,原核表达系统-细菌,特点：繁殖快、易于培养， 限制： 表达的蛋白质缺乏转录后的修饰； 原核系统表达的蛋白一般为胞内产物，需要破碎细胞提取产物，给产物的分离纯化带来困难； 还易受外源毒素的污染。,47,真核表达系统,特点 表达后的蛋白有修饰作用，与人体自身分泌的天然蛋白非常近似； 动物细
15、胞表达的蛋白都是胞外分泌，产物的分离纯化过程非常简单。但是，动物细胞大规模培养比较复杂，目前仍处于发展完善阶段。,48,表达系统的选择,原核表达系统：一般“小分子、结构简单”的蛋白生产，且蛋白转录后无需修饰，如胰岛素； 真核表达系统：主要“生产大分子、结构复杂的蛋白”，并且转录后的修饰对蛋白的生物活性具有重要影响，如组织型纤溶酶原激活剂(tPA）、促红细胞生成素等（EPO）等。 对既可用原核、可用真核表达的蛋白如-干扰素、人生长激素等，应综合考察生产的经济成本和技术难易程度等选择表达系统。,49,口蹄疫疫苗生产示意图,50,过去使用动物生产的生物制品，经常发生过敏反应或病原体传染事件。如脊髓灰
16、质炎疫苗可能被猿猴肾病毒污染；用人血制备的某些生物制品可能被肝炎或艾滋病病毒污染。 采用细胞工程生产的产品能将致病因素降到最小：动物细胞培养所用的细胞背景明确，经过严格的安全检测，消除了污染病原体的危险。,51,实例,EPO的生产：以前需要从2500L再生障碍性贫血病人的尿液中才能提取极微量的EPO用于实验室分析。现在，通过大规模培养基因工程细胞生产的EPO，已经治疗了成千上万的肾性贫血的病人。 胰岛素的生产：过去从猪胰腺中提取胰岛素，但某些患者会引起抗原抗体反应。基因工程可以用人胰岛素基因生产人源化蛋白，克服免疫反应的缺点。,52,动物细胞表达系统的不足细胞生长缓慢，生产效率较低，产量远远落后于其他表达系统。如骨髓细胞MPG-11生产IgG， 每个细胞1分钟为5pg，10L反应器，细胞密度为107/mL，生产能力不到1 g/d。连续细胞系增加了生长和代谢速率，但同时导致了副产物的增加。,53,动物细胞对培养条件要求苛刻和敏感，对温度、pH、渗透压、剪切力等忍受能力差。需要添加氨基酸、维生素、 血清、生长因子等， 培养基要求高，生产费用较高。,
