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1、聚合酶链式反应及其污染 与预防污染的措施,协和医院 李一荣,临床基因扩增 检查验收中存在的问题,5份标本(2份标本小于最低检测限) 检测结果: (1) 与预期靶值完全符合 (2) 阴性对照出现阳性， 小于最低检测限的标本为阳性 (3) 阳性标本高于预期值2个数量级. (4)所有阳性标本均低于预期靶值1个及以上数量级.,聚合酶链式反应 成功的关键因素,保证标本质量与模板质量 PCR反应体系与反应条件的优化 PCR相关仪器的校准 灵敏度、特异性 批内与批间检测的可重复性 预防污染的发生(假阳性),Stephen AB et al.Real-time reverse transcription PC
2、R (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science (2005) 109, 365379,标本质量与模板质量,Real time PCR，2006,认真分析标准曲线观察PCR反应体系与反应条件是否正确,1.相关系数（r2）：越接近1越好 2.斜率（slope）：-3.13.6 （100%的扩增效率） 3.截距（intercept）：33.336.5 （100%的扩增效率）Ct=A+BlgC,Ct,3733,123,斜率=-3.5,斜率=-2.0,标准曲线的要求 扩增效率：通常要求达到90%100%，
3、 如小于90%，必须重新优化。对应的 斜率10（-1/斜率）-1为-3.1-3.6。 截距（灵敏度）：33.336.5 （100%效率） 相关系数：检测标准品稀释的 准确性与加样的准确性（0.99）,Real time PCR，2006,斜率增加： （1）标准品为非线性的质粒。 （2）反应体系与反应条件未优化好。 （3）存在Taq酶的抑制剂或Taq酶的活性下降。 （4）加样不准确 斜率降低：污染或加样不准确。 截距增加： （1）标准品的浓度不正确。 （2）标准品降解（反复冻融或未加载体DNA的低浓度标准品） 截距降低： （1）标准品的浓度不正确。 （2）污染。,PCR相关仪器的校准,批内与批间
4、检测的可重复性,TBDNA（+）,污染,Why？,方法本身？ 实验人员？ 实验场地？ 实验试剂？,聚合酶链式反应与诺贝尔化学奖,美国科学家Kary B.Mullis,Kary B.Mullis与 聚合酶链式反应,“我感激诺贝尔评奖委员会，在我还能够尽情 享受生活的年龄及时地把诺贝尔奖授予给我”,PCR的污染源,交叉污染。 来自试验材料 。 “遗留”(carryover)污染。,PCR去污染（decontamination）的措施,停止试验，寻找污染源。 抛弃所有可疑的试剂。 工作区间彻底的清洁消毒。 更换实验设备。 改用另一对引物，扩增靶DNA的不同区域。,PCR的基本步骤与污染的发生,Rea
5、gent preparation Specimen preparation Amplification Detection Results Calculation,预防污染的措施,建立标准的PCR实验室，将PCR的不同过程在不同的区间进行。为污染控制策略的核心部分。 酶法防止PCR产物的遗留污染。 表面紫外线照射减少PCR的污染。 用化学加合物如异补骨脂素将单链或双链DNA衍生化，这些加合物可防止污染的DNA作为反应的底物。,标准实验室的组成及其功能（1）,前PCR区（Pre-PCR laboratory）：又称试剂贮存与准备区，用于试剂的制备、分装、贮存以及配制PCR反应的“主混合物”,反
6、应 混 合 物 的 成 分,Mg2+,Mn2+,dCTP,dGTP,dUTP,dATP,Taq DNA 多 聚 酶,rTth DNA 多 聚 酶,AmpErase,生 物 素 标 记 的 引 物,和或 和,主混合物,标准实验室 的组成及其功能（2）,标本处理区（Sample processing laboratory）：标本的保存，目的核酸的提取、贮存，目的核酸的添加以及cDNA的合成。,Mn2+,AmpErase,rTth DNA Polymerase,Biotinylated Primers,Target RNA or DNA,Reverse Transcription,dCTP,dTTP
7、,dGTP,dUTP,dATP,Biotinylated Amplicon,Biotinylated Amplicon,标准实验室的组成及其功能,PCR扩增区（PCR amplification laboratory）：DNA或cDNA的扩增。 PCR产物分析区（PCR product analysis laboratory）：又称后PCR区，PCR产物的检测与分析。,Step 2. Denaturation and Hybridisation,Denaturation,BSA,BSA,AMPLICON,AMPLICON,Denatured Strands,Biotin,Hybridisati
8、on,Capture Probe linked to BSA,Step 3. Binding of a Av-HRP Conjugate and Addition of Substrate,(Incubate at 37 C),Capture Probe,Magnetic Microparticles,Avidin-horseradish Peroxidase Conjugate,Biotin,Amplicon,Tetramethylbenzidine (TMB) Substrate,MMP,MMP,TMB,Hydrogen Peroxide,o,Step 4. Stop Solution A
9、ddition and Absorbance Measurement,Add Stop Solution and Measure Absorbance,Capture Probe,Microwell Plate,Addition of Substrate,Tetramethylbenzidine (TMB) Substrate,Biotin,BSA,AMPLICON,BSA,AMPLICON,Hydrogen Peroxide,Avidin-horseradish peroxidase (Av-HRP conjugate),标准实验室的基本规章制度,所有进入实验室的人都要遵守该制度。 明确试验
10、目的是否与实验室功能一致。 明确试验中的不确定因素。,物流和人流,单向流动的原则。 从“干净”的实验室到“脏”的实验室,工作服,(1)在实验室指定区域内更换指定的工作服。 (2)实验室中应频繁更换手套。 (3)一次性实验室用品(包括一次性手套与鞋套)应丢弃到生物危险废料容器中。 (4)工作衣不能穿出指定的实验室外。,实验室卫生,实验室设备必要时应用10%漂白剂清洗。 所有实验室废物均应按照生活垃圾、医用垃圾、尖锐状废料以及破碎的玻璃器皿进行分类，尤其是感染性废料必须高压消毒后方能丢弃。,防护罩/超净工作台,工作前，工作台表面应用75%酒精擦拭台面，紫外灯消毒， 工作后，把物品移出，用75%酒精
11、擦拭台面，并打开紫外灯消毒。,几点建议,(1)所有试剂与样品准备过程中应使用一次性灭菌的管子与瓶子 (2)每次实验应设阴性对照. (3)将标准品与阳性对照直接储存在标本处理区，标准品的稀释(管子离心后5min打开,以避免气溶胶的产生。不能剧烈振荡标准品与阳性对照) (4)正确使用微量加样器 (5)定期用10%的次氯酸钠清洁微量加样器与工作台面 (6)换气设备应正常工作.,三、酶法防止PCR产物 的遗留污染,限制性核酸内切酶法。 修饰引物，使扩增产物被某种酶切割。 UNG消解法,UNG消解法原理,1）在PCR反应体系中加入UNG，并用dUTP替代dTTP，扩增产物含有dUTP 。 2）UNG可以
12、去除遗留污染DNA中的dU， DNA聚合酶会在这些位点处停滞。 3）无dU的位点是热不稳定的，在热循环中会发生断裂。,以dUTP替代dTTP的PCR扩增产物，“ ”表示dUTP,再次扩增，扩增体系加入UNG，37度10分，可消去dU。,95度10分钟，DNA在无dU的区域断裂， 因此遗留的DNA不能被扩增,UNG消解法的缺点,短于100bp的PCR产物不能用UNG完全消除污染，,四、表面紫外线照射减少PCR污染的原理,紫外线(Ultraviolet、UV)诱导DNA的损伤是通过在相邻的嘧啶碱基(CT、TT、TC、CC)之间形成环丁烷环而发生的，环丁烷环形成链内的嘧啶二聚体，从而抑制了聚合酶介导
13、的链延伸反应。,变性,退 火,5,3,5,3,5,5,5,3,3,紫外线照射,延伸,5,5,3,3,特 点,需要较长的时间，不能消除所有污染， 对序列长度有一定的依赖性，当DNA片段小于300bp时效果较差。 被消毒表面应与UV光源垂直以达到最大的光强度。 靶分子被遮蔽，则失活效率不高。 UV照射具有致突变性，并可引起视力下降或致盲。,去污染方法,紫外灯在工作区不使用的所有时间内始终打开。 使用后将紫外灯打开以消除工作空间的污染。再次准备工作之前再将紫外灯关掉。 紫外线照射时间依具体情况而定。,结 论,紫外线照射是其他适当技术的辅助手段.，为保持PCR实验室的无污染提供额外的安全保证。,谢 谢,
