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1、鱼类的急性毒性实验,制作人：蔡浩 协作者：李目，李行,监测0936生物监测课程第四组,Company Logo,目录,Company Logo,通过本实验，熟悉和掌握鱼类急性毒性试验的设 计、条件、操作步骤，以及试验结果的计算、分析 和报告等全过程。,目的与要求,Company Logo,鱼类对水环境的变化反应十分灵敏，当水体中的污染物达到一定程度时，就会引起一系列中毒反应，例如行为异常、生理功能紊乱、组织细胞病变、直至死亡。在规定的条件下，使鱼接触含不同浓度受试物的水溶液，实验至少进行24h，最好以96 h为一个实验周期，在24h、48h、72h、96h时记录实验鱼的死亡率，确定鱼类死亡50
2、时的受试物浓度。鱼类毒性试验在研究水污染及水环境质量中占重要地位。通过鱼类急性毒性试验可以评价受试物对水生生物可能产生的影响，以短期暴露效应表明受试物的毒害性。鱼类急性毒性试验不仅用于测定化学物质毒性强度、测定水体污染程度、检查废水处理的有效程度，也为制定水质标准、评价环境质量和管理废水排放提供环境依据。,实验原理,Company Logo,1实验鱼的选择、收集与驯养试验用的鱼必须对毒物敏感，具有一定的代表性，便于实验条件下饲养，来源丰富，个体健康。我国可采用的试验鱼有四大养殖淡水鱼（青鱼、草鱼、鲢鱼和鳙鱼）、金鱼、鲫鱼、野生的食蚊鱼等。在同一实验中要求试验鱼必须同属、同种、同龄、同大小。最好
3、是当年生。鱼的平均体长以不超过57cm为合适。金鱼体短、身宽，一般以3cm较为合适。同组鱼中最大的体长不应超过最小的体长的1.5倍。,实验材料,注意：在毒性实验报告中，鱼类名称要使用正式种名，即拉丁学名。,Company Logo,选用的试验鱼在试验前必须在实验室内经过驯养，使之适应实验室条件的生活环境和进行健康选择。驯养鱼应该与试验相同水质水温的水体中至少驯养7d，使其适应试验环境，不应长期养殖（2个月）。驯养期间，应每天换水，可每天喂食1-2次，但在试验前一天应停止喂食，以免试验时，剩余饵料及粪便影响水质。驯养期间试验鱼死亡率不得超过5，否则，可以认为这批鱼不符合试验鱼的要求，应该继续驯养
4、或者重新更换试验鱼进行驯养。试验前必须挑选健康的鱼，即选择体色光泽、鱼鳍完整舒展、行动活泼、逆水性强、大小无太大悬殊、无任何疾病的鱼作为试验鱼。任何畸形鱼、外观上反常态的鱼都不得作试验鱼。,Company Logo,2实验仪器设备（1）实验容器实验容器一般用玻璃或其他化学惰性材质制成的水族箱或水槽。容器体积可根据试验鱼的体重确定，通常以每升水中鱼的负荷不得超过2g（最好为1g）。一些小型鱼类幼鱼可选择500mL或 1000mL烧杯为实验容器。容器的深度必须超过16cm，水体表面积越大越好。同一实验应采用相同规格和质量的容器。为防止鱼类跳出容器，可在容器上加上网罩。实验容器使用后，必须彻底洗净，
5、以除去所有毒性残留物。我们用到的是大型水桶，水规格是40L。（2）其他溶解氧测定仪、水硬度计、温度控制仪、pH计、分析天平。,Company Logo,3实验用水（稀释水）及水质条件用来驯养和配置实验液的水，必须是未受污染的清洁水。一般可采用天然河水、湖水或地下水，但需过滤以除去大的悬浮物质。也可用自来水代替，但必须进行人工曝气或放置3d以上脱氯。如果试验目的是评价工业废水或化学物质对接纳水体的影响时，则最好采用接纳水体的污染源上游水作为试验用稀释水。蒸馏水不适合做稀释水，因为蒸馏水中已除去了自然界水中的盐类，与实际差距太大，另外由于蒸馏器的影响，有时使蒸馏水中带有对鱼类不利的金属离子，影响试
6、验结果。,Company Logo,实验用水的水质条件一般是指水的温度、pH、溶解氧、硬度、水中的有机物和水量等。（1）水温实验中应保持鱼类原来的适应温度，一般冷水鱼在1218，温水鱼在2125。为使得实验结果可靠，在同一实验中，温度的波动范围不要超过2（即1）。冬天可以通过加热室内的空气温度而达到调节水温的目的，也可以采用电热棒直接控制调节水温。,Company Logo,（2）pH水的pH与水生生物的代谢作用有密切关系。对毒物的毒性作用也有一定的影响。因此，在实验中应维持pH在鱼类适宜范围内。一般实验液的pH在6.08.5为宜。如需调节pH，可用1M或0.1M的HCl和NaOH来调节受试物
7、贮备液的pH。调节贮备液的pH时不能使受试物浓度明显改变，或发生化学反应或沉淀。（3）溶解氧溶解氧是鱼类生存的必要条件，它能影响鱼类对毒物的敏感性。一般温水鱼要求溶解氧在4mg/L以上，冷水鱼要求溶解氧在 5mg/L以上，每日光照1216h。（4）硬度水的总硬度为 19250 mg/L（以CaCO3计）。,Company Logo,1预实验用确定正式实验所需浓度范围，可选择较大范围的浓度系列，如1000mg/L、100mg/L、10mg/L、1mg/L、0.1mg/L。每个浓度放入五条鱼，可用静态方式进行，不设平行组，试验持续4896h。每日至少两次记录各容器内的死鱼数，并及时取出死鱼。求出2
8、4h100死亡浓度和96h无死亡浓度。如果依次预试验结果无法确定正式试验所需的浓度范围，应另选一浓度范围再次进行预试验。,Company Logo,2正式实验根据预试验得出的结果，在包括使鱼全部死亡的最低浓度和96 h鱼类全部存活的最好浓度之间至少设置5个浓度组，并以几何级数排布。浓度间隔系数应2.2。每个试验浓度组应至少设23个平行，每一系列设一个空白对照。如使用了助溶剂，应增设溶剂对照组，其浓度与试剂中的最高溶剂浓度相同。试验鱼的数目以每组（浓度组和对照组）至少7尾合适，建议取10尾。试验溶液调节至相应温度后，从驯养鱼群中随即取出鱼并随机迅速放入各试验容器中。转移期间处理不当的鱼均应弃除。
9、同一试验，所有试验用鱼应30min内分组完毕。,Company Logo,在24h、48h、72h、96h后检查受试鱼的状况。如果没有任何肉眼可见的运动，如鳃的扇动、碰触尾柄后无反应等，即可判断该鱼已死亡。观察并记录死鱼数目后，将死鱼从容器中取出。应在试验开始后3h或6h观察各处理组鱼的状况，并记录试验鱼的异常行为（如鱼体侧翻、失去平衡，游泳能力和呼吸能力减弱，色素沉积等）。试验开始和结束时要测定pH、溶解氧和温度。试验期间，每天至少测定一次。至少在试验开始和结束时，测定实验容器中试验液的受试物浓度。试验结束时，对照组的死亡率不得超过10。,Company Logo,1数据处理以暴露浓度为横坐
10、标，死亡率为纵坐标，在计算机或对数概率纸上，绘制暴露浓度对死亡率的曲线。用直线内插法或常用统计程序计算出 24h、48h、72h、96h的半致死浓度（LC50）值，并计算95的置信限。如果试验数据不适于计算LC50，可用不引起死亡的最高浓度和引起100死亡的最低死亡浓度估算LC50的近似值，即这两个浓度的集合平均值。,Company Logo,2化学物质急性毒性分级依据LC50值的大小，可以将化学物质的急性毒性分为剧毒、高毒、中等毒、低毒和微毒5级，如实验表3-1所示。,实验表3-1 鱼类急性毒性实验毒性分级标准,Company Logo,3编写报告在实验报告中应包括：试验名称、目的、试验原理
11、、试验的准确起止日期，还有如下几项：（1）试验鱼的种名、来源、体重、体长、健康和驯化状况。（2）受试物质名称、来源物化性质和保存方法。（3）实验用水的来源、物化性质和实验前的处理等。（4）实验溶液的浓度与配置方法、实验温度。（5）实验条件，如容器形式、实验液的体积与深度、受试生物数目及负荷率。（6）实验开始后24h、48h、72h、96h时的LC50值，及其毒性分级。,Company Logo,（1）试验期间，对照组鱼死亡率不得超过10。 （2）试验期间，受试物实测浓度不能低于设置浓度的80。如果试验期间受试物实测浓度与设置浓度相差超过20，则应该以实测受试物浓度来表达试验结果。 （3）试验期间，尽可能维持恒定条件。 （4） 试验期间，实验溶液的的溶解氧含量应大于60%的空气饱和值。,）,Company Logo,谢谢！,
