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1、,实验六 醋酸纤维薄膜电泳分离 血清蛋白质,临床生化实验室,一、实验目的,1. 掌握电泳分离的蛋白质的基本原理 2. 熟悉醋酸纤维薄膜电泳技术,二、实验原理（一）,电泳：带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。 电泳技术: 利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术。,二、实验原理（二）,蛋白质是两性电解质。血清中各主要蛋白质的等电点均低于pH7.0，在pH8.6的碱性缓冲液中，电离成负离子，在电场中向正极泳动。 因血清中各种蛋白质的pI值不同，在同一pH缓冲液中带电荷量会有不同，此外，各蛋白质的分子大小和形状也不一致，所以在同一电场中，各蛋白质的电泳迁移率也不同。带电荷多、
2、分子量小者，泳动较快，反之则慢。,醋酸纤维薄膜电泳可将血清蛋白分成五条主要区带，从正极端起依次为清蛋白/白蛋白Alb， 1-球蛋白，2-球蛋白，-球蛋白, -球蛋白。这些蛋白经过染色处理，可展示出清晰的蛋白电泳图谱。如下图所示。,二、实验原理（三）,由于染色时，染料与蛋白质的结合与蛋白质的量成正比。因此可将实验图片扫描后，根据每个蛋白条带的光密度，采用软件计算每种蛋白质的相对含量。 也可将各蛋白区带剪下，分别用一定量的NaOH稀溶液洗脱，进行比色，测出各蛋白质区带的相对含量。,二、实验原理（四）,蛋白定量：,影响电泳的因素,三、实验器材,卧式电泳槽,DYY-2型电泳仪,醋酸纤维薄膜（CAM,2
3、 cm8cm）：1片/人。 染色缸1个，公用。 漂洗缸3个，公用。 点样器：公用。 滤纸：公用。 镊子：公用。,脱色摇床,扫描仪,四、实验试剂,巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6，离子强度0.06）染色液（丽春红S染液）漂洗液：3%（V/V）冰醋酸,迎着光辨别醋酸纤维薄膜（CAM）的光面和毛面。 在毛面的一端1.5cm处，用直尺和铅笔轻划一横线，做点样标记，并用铅笔标号。 将已经编号、标记的CAM膜以毛面朝下的方式浸入巴比妥缓冲液中，浸泡30 min。,五、实验操作,实验准备： 1）醋酸纤维薄膜的准备,电泳装置由电泳槽和稳压电源两部分组成，两者之间有专门的连线连接。电泳槽的正负极各有一个装缓冲
4、液的槽，红色为正极，黑色为负极。 电泳槽置于水平台，两侧注入等量的巴比妥缓冲液，使其在同一水平面。用双层纱布搭桥。,2）电泳装置的准备,1）用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，然后平铺在桌子上（毛面朝上）。 2）在一次性手套上滴一滴血清（3-5l），用点样器在血清上蘸一下，再将点样器轻印在CAM膜的点样线上，待血清完全渗透到薄膜内后移开。,2.点样,1）将加样后的薄膜，毛面向下，垂直架于电泳槽的游杆两端，点样端置于负极，纱布将膜的两端与缓冲液连通 2）将电泳槽的正极和负极分别与电泳仪的正极、负极连接，打开电源，低压，平衡5min。调节电压至90-150V (110V),稳压
5、电泳45min。 3）待电泳区带展开约25-35mm后，关闭电源。,3.电泳,电泳完毕后，取出薄膜，以毛面朝下的方式浸于丽春红S染色液中，染色5-10min。,4.染色,将染色过的薄膜依次放在漂洗缸1,2,3中漂洗，每次5 min,5.漂洗,将漂洗好的CAM薄膜放置在滤纸上，吸干水分，放入扫描仪中进行扫描，并用软件分析各种蛋白质的相对含量。,6.定量,各组分蛋白%=AX/AT 100%AX:各组分蛋白光密度值AT:血清各组分蛋白光密度值之和,7.计算,薄膜的浸润是电泳成败的关键之一。点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，但不宜太干。点样时，动作要轻、稳，用力不能太大。电泳时应选择合适的电
6、压，一般稳压在为110 V。通电时，不得接触槽内的缓冲液或CAM，以防触电。电泳槽缓冲液的液面要保持一定的高度，同时电泳槽两侧的液面应保持在同一水平，否则，通过薄膜时有虹吸现象，影响蛋白分子的泳动速度。,六、注意事项,七、实验结果,正常参考值,清蛋白 57-68% a1-球蛋白 1-5.7% a2-球蛋白 1.12-4.9% -球蛋白 7-13% -球蛋白 9.8-18.2%,九、临床意义,正常血清蛋白电泳一般可分为5条区带，即Alb，1，2，,球蛋白。 1. 脐带血清、胎儿血清、部分原发性肝癌血清在Alb和1球蛋白之间可增加一条甲胎蛋白带。 2.M蛋白血症 单克隆球蛋白（M蛋白）血症，主要见
7、于多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、重链病以及一些良性M蛋白增多症。在和球蛋白后区段的各部分出现一条致密浓集的M蛋白带。 3.蛋白缺乏症 主要包括a1抗胰蛋白酶缺乏症、球蛋白缺乏症等。临床上较少见，电泳图表现为a1或球蛋白缺乏或显著降低。,异常的血清蛋白电泳可见以下疾病：,4.急慢性肾炎 表现为a1、a2、和三种球蛋白均增高。 5.肾病 见于急慢性肾炎、肾病综合症、肾衰竭等。表现为Alb降低、a2和球蛋白升高。 6.肝病 包括急慢性肝炎和肝硬化，主要表现为Alb降低， 和球蛋白增多，出现和球蛋白难以分离而相连的“-桥”，主要是因为IgA的增高所致。IgA与肝纤维化有关。,临床意义,八、方法学评价,优点：CAM电泳具有灵敏度高，标本用量少，分辨率高，区带清晰，电泳时间短，操作简便快捷，CAM对染料不吸附，蛋白区带均匀，背景清晰，既易染色定量，又易透明后进行光密度扫描。 缺点：有轻微电渗现象，薄膜吸水性差，电阻容易增加，当电流较大时，薄膜中水分极易蒸发，造成蛋白质分子变性破坏。,电泳时，血清样品点在支持介质的哪一端，为什么？ 电泳图谱清晰的关键是什么？,思考题,
