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1、植物组织培养实验,实验一 培养基贮备液（母液）的配制,目的与要求：熟悉MS培养基的组成，掌握贮备液的配制方法. 实验步骤：称量 分别溶解 混合 定容。,一，MS培养基的组成,1、大量成分贮备液I mg/LNH4NO3 1650KNO3 1900CaCl2 2H2O 440MgSO4 7H2O 370KH2PO4 170配制20倍浓度贮备液500mL.,2、微量成分贮备液II mg/LKI 0.83H3BO3 6.2MnSO4 4H2O 22.3ZnSO4 7H2O 8.6Na2MoO4 2H2O 0.25CuSO4 5H2O 0.025CoCl2 6H2O 0.025,配制100倍浓度贮备液1
2、00mL.,3、铁贮备液III mg/LFeSO4 7H2O 27.8Na2 EDTA 2H2O 37.34、有机成分贮备液IV mg/L肌醇 100烟酸 0.5盐酸硫胺素(VB1) 0.1盐酸吡哆醇 0.5甘氨酸 2,配制100倍浓度贮备液100mL.,配制100倍浓度贮备液100mL.,二，常用生长调节剂,6-BA：1mg/mL(溶于少量1N盐酸后以蒸馏水定容）。NAA:1mg/mL（先用少量95%乙醇溶解后以蒸馏水定容）。,三、作业：,（一） 一般可将MS培养基分为哪四个部分？分别含有几种试剂？各种试剂的浓度（mg/L）如何？（二） 如需配制MS培养基的20的贮备液I量为500 mL、1
3、00的贮备液II、III和IV各100 mL以及BA和NAA（浓度为1 mg/mL）各50 mL，则应分别称取多少量的各种试剂？注意要点有哪些？,实验二 固体培养基的配制与灭菌,一、实验目的：学习、掌握植物组织固体培养基的配制和灭菌方法。二、实验步骤：称量 混合 调pH值 灭菌,称量：按每瓶培养基终体积50mL计，称取适量的琼脂（常用量8g/L）和蔗糖（常用量30g/L），置于大烧杯中，加蒸馏水至需配培养基终体积的3/4左右，（加热）使之溶解。 混合：分别加入一定量的贮备液I、II、III、IV和生长调节物质及其它特殊补加物，再加蒸馏水直至需配培养基的终体积。 调pH值：充分混合后，在60水浴
4、条件下用0.1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L的HCl调节培养基的pH值至5.8。 灭菌：封严培养容器口后，120 灭菌20 min后，将培养基取出，置于水平台子上，在室温下冷却，备用。,实验三 外植体材料的预处理、 消毒及接种,一、实验目的：熟悉外植体材料的预处理，掌握其消毒和接种方法。,二、方法步骤：,（一）对采来的植物材料进行适当的预处理。除去不需要的部分，将所需部分切割至适当大小，置自来水龙头下流水冲洗几分钟至几小时，主要视植物材料清洁程度而定。这在污染严重时特别有用。,（二）用洗衣粉水（12角匙洗衣粉/100 ml水）等浸洗上述植物材料约5 min，再用自来水冲净洗衣粉水。
5、这是进一步减少污染的处理。 同时配制消毒液：50%次氯酸钠溶液。,（三） 将接种用具、无菌水等从80烘箱中或直接从高压灭菌器中取出，置于超净工作台上。打开超净工作台中的紫外灯，在进行紫外线灭菌处理至少30 min后关掉紫外灯。,（四） 操作人员洗手擦干，换上洁净工作服，戴上帽子以免头发散落以及带来污染。坐到超净台前，并将装有经湿热灭菌培养基的培养瓶、配好的消毒液、洗净沥干的植物材料置于超净工作台上，用70%酒精棉球擦手与器具外壁，即可对经上述预处理的植物材料进行表面灭菌处理，自此以后各步均须在超净工作台上操作。,（五）具体首先将经上述预处理、沥干水的植物材料放入广口瓶或烧杯，向其中倒入新鲜配制
6、、浓度一定并且加有一定量（通常为灭菌剂消毒液的0.5%，或每100 mL消毒液滴加1015滴）Tween-80（土温-80）等表面活性剂的消毒液适量（液面高度超出植物材料至少0.5 cm），开始计算灭菌时间。也可在使用上述灭菌剂之前，先将植物材料浸于70%乙醇灭菌1030秒。,（六）在持续灭菌时间内定时用玻璃棒轻轻搅动，以促进植物材料各部分与消毒液充分接触，驱除气泡，使灭菌彻底。在灭菌时间结束前1 min时，即可开始用玻璃棒等轻轻压住植物材料将消毒液慢慢倒入废物缸，注意勿使植物材料滑出。接着立即倒入适量无菌水，轻搅植物材料以清洗去除灭菌剂残留。一般表面灭菌时间的计算是从倒入消毒液开始，到倒入无
7、菌水为止。无菌水的清洗时间每次约3 min；清洗5次。,（七）倒出、沥去最后一次清洗用水，开始进行植物材料的切割及接种。逐一取出经上述灭菌处理的植物材料，置于下面垫有经灭菌处理的培养皿（或小白瓷碟）的无菌纱布或滤纸上，左手拿小镊子，右手拿解剖刀，切除各切段或切块上被灭菌剂毒坏的部分。如有必要，也可再行切分。在完成切割后，将解剖刀和小镊子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后放回原处，以便待冷却后下一切割再用。,（八）接着，左手拿培养瓶，将培养容器口外壁在靠近酒精灯外焰处转燎数秒，以将其可能带有的微生物等固定于原处；在酒精灯焰附近处，用右手拇指与食指配合将瓶塞打开，并将其夹于左手无名指
8、与最小指之间；再将培养瓶口在酒精灯焰上轻转灼烧灭菌；以右手拇指与食指配合，用大镊子夹紧一外植体准确送入培养容器，并将其轻轻地半插入固体培养基；将大镊子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后放回原处，以便待冷却后下一操作再用；将培养瓶口及瓶塞分别在酒精灯焰上小心地轻转灼燎数秒；盖好瓶塞，旋紧，将其置于超净工作台的适当位置。,（九） 在完成了该第一只培养容器的外植体接种操作后，用70%乙醇对超净工作台的台面进行擦拭灭菌，接着再进行第二只培养容器的外植体接种及超净台台面的灭菌，直至全部完成。,三、作业：,练习无菌操作；统计植物材料表面灭菌结果；分析污染原因；提出减少或避免污染的措施。,实验
9、四 枝芽增殖培养基的 设计与配制,一、实验目的：学习、掌握枝芽增殖培养基的设计、配制方法。,二、方法步骤：,（一）称取4 g琼脂和15 g蔗糖，加蒸馏水至需配培养基终体积500 mL的3/4，加热使之溶解，并在80热水浴中保温。 （二）分别加入一定量的MS培养基贮备液I、II、III和IV及NAA 0.25 mg，然后15各小组再分别加入各自不同量的BA（0.25；0.5；0.75；1及1.5 mg）。 （三）充分混匀后，用0.1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L的HCl调节培养基的pH至5.8。定容至500 mL。 （四）将培养基分装到所选用的培养容器中，每个容器的装量不超过其最大容
10、量的1/3。拧紧瓶盖。 （五）将装有培养基的培养容器置高压灭菌器中高压灭菌（120，20 min）。灭菌结束后从高压灭菌器中取出，置于平台上冷却，备用。,三、作业：,在进行枝芽增殖培养基设计时，应注意哪些问题？,实验五 枝芽增殖培养的外植体的处理与接种,一、实验目的：学习、掌握枝芽增殖培养外植体的处理、接种方法。,二、方法步骤：,（一）将经湿热灭菌装有培养基的培养容器、接种用具等置于超净台上，打开超净台的紫外灯，灭菌处理30 min。 （二）操作人员坐到超净台前，用浸有70%酒精的棉球擦超净台面、操作者手等部分。 （三）点燃酒精灯，从装有无菌苗的培养瓶中取出无菌苗，置于无菌的培养皿中的无菌滤纸
11、上，用灭过菌的刀和镊子配合操作，从叶柄处切下，将所有叶片去除，只留下近茎部的一小段叶柄。 （四）将去除叶片后的茎，切分成带腋芽的茎段。(五）打开培养容器盖子，将茎段按其自然极性方向垂直插入培养基，盖好培养容器盖子，置于超净台上适当位置。对接种用具、超净台面、操作者手等进行适当灭菌处理，继续接种。如此操作，直至完成。,三、作业：,进行增殖试验结果的观测、比较、记录和分析。,实验六 根再生诱导培养基的 设计与配制,一、实验目的：学习、掌握根再生诱导培养基的设计、配制方法。,二、方法步骤：,（一）称取4g琼脂和15g蔗糖，加蒸馏水至需配培养基终体积 500 mL的3/4，加热使之溶解，并在80热水浴中保温。 （二）分别加入一定量的MS培养基贮备液I、II、III和IV，然后15各小组再分别加入各自不同量的NAA（0.25；0.5；0.75；1及1.5 mg）。 （三）充分混匀后，用0.1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L的HCl调节培养基的pH至5.8。补加蒸馏水至培养基的终体积500 mL。 （四）分装后，将装有培养基的培养容器置高压灭菌器中高压灭菌（120，20 min）。 （五）将灭过菌的装有培养基的培养容器从高压灭菌器中取出，置于平台上冷却，备用。,三、作业：,在进行根再生诱导培养基设计时，应注意哪些问题？,
