《转基因动物技术课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《转基因动物技术课件（46页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Transgenic Technology,DefinitionTransgenic technology refers to the genetic engineering of an organism so that its genomic DNA is altered to over- or underexpress certain genes.,Transgenic technique Gene Knock Out Gene Knock In Gene Knock Down Gene Trappingmouse, rabbit, rat, sheep, pig, caw etc.,Th
2、e 2007 Nobel Prize in physiology or medicine is awarded for their discoveries of principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells.,Oliver Smithies Martin J. Evans Mario R. Capecchi,Evanss work: The ES cells,Stem cellMartin talks about his work,embryon
3、ic stem cell，ES,somatic stem cell,Mario Capecchi and Oliver Smithies, independently of each other, discovered how homologous recombination between segments of DNA molecules can be used to target genes in the mammalian genome and developed methods to generate genetically modified mice.,转基因小鼠构建过程,构建打靶
4、载体 ES细胞打靶和筛选 囊胚注射 动物杂交筛选,北京诺兰信科技 北京高校生物技术转化平台,http:/ Health Sciences Drive Stony Brook, NY 11790-3350，USA,一、打靶载体,定点突变技术,STRATAGENE， Agilent Technologies Inc,分子开关-Cre/Loxp 系统,Cre：由P1噬菌体编码的约38KD的重组酶，不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的 DNA 序列。 可以特异性的识别并催化34个碱基重复序列的loxP之间的DNA同源重组。Loxp位点： locus of crossing-over (x)
5、 in P1 site:,Cre-LoxP系统的特性,Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程，可以分成三种情况： 1、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列； 2、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位； 3、如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。,两个loxp位点的方向相反,Cre,loxp,loxp,Gene,Gene,promoter,promoter,loxp,loxp,Knoc
6、k-out gene Knock-out stop cassetteKnock-out label,FLP/frt重组系统,来自啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 其中重组酶FLP可催化位于同一分子上两个同向frt位点间DNA片段的同源重组，实现基因切除的效果。 作为“第二分子开关” FLP/frt系统与Cre/loxP系统一起，更精密的调控基因表达,时间控制和组织特异性表达,Cre的表达还可以通过在启动子上引入相应某种配体的元件(比如某种药物)而达到时间控制和组织特异性表达。 四环素、1型干扰素、三苯氧胺(Tamoxifen，可以与一种与雌激素受体相互作用的蛋白相结
7、合)都被用于获得药物诱导型的启动子。,LSL-Cre : loxp-stop-loxp, Cre FSF-Flpo: FRT-stop-FRT, Flpo Established Lung Tumors,Si-Bmi-1,二、ES细胞打靶和筛选,HSV-tk：单纯疱疹病毒胸苷激酶，自杀基因 HSVtk基因的产物使细胞能利用培养基中的GANC (Gancyclovir，丙氧鸟苷）而死亡 例如将在肝癌细胞中可表达AF基因的调控区与水痘一带状疮疹病毒中的胸苷激酶（VZV-TK）基因进行重组，构建逆转录病毒载体导入体内，TK基因只在肝癌细胞中表达，产生的TK可催化6-甲基嘌呤阿拉伯糖核苷磷酸化产生ar
8、aAMP，进一步磷酸化形成细胞毒物质araATP，杀死肝癌细胞。,Neo基因卡那霉素抗性基因编码的是新霉素磷酸转移酶II，基因记做neo，能通过降解G418、新霉素和卡那霉素来实现真核和原核细胞的相应抗性。一般应用于原核生物就是卡那霉素抗性基因,应用于真核生物就是G418抗性。,外源基因导入ES细胞的方法有:1.电穿孔法2.逆转录病毒载体法3.脂质体包装法4.磷酸钙沉淀法,三、囊胚注射和杂交筛选,小鼠基因型的鉴定？,标准品系： ES细胞品系：E14Tg2a (129背景)； JM8(C57BL/6N品系)； JM8A3(C57BL/6N 品系，Agouti毛色) 注射用囊胚品系：C57BL/6
9、C57BL/6,129和C57BL/6纯系小鼠近交系Inbred Mice,C57BL/6,129,C57BL/6品系较纯，回交较少代数后性状就能稳定。 129品系ES细胞的优点是它们比较皮实，容易操作。 C57BL/6 ES cell比较娇嫩。,表1.用基因打靶法制备的一系列重要的基因敲除小鼠及表型：敲除基因 表现型 RAG-1和/或RAG-2 因无TcR基因重排而无T细胞 TcR 双阴性胸腺细胞聚集，双阳性胸腺细胞很少，TcR正常重排 TcR 有双阴和双阳T细胞而无单阳性T细胞 P56lck T细胞发育在早期双阳性成熟期受阻，无T细胞 CD3- T细胞发育在早期双阳性成熟期受阻 CD45
10、T细胞发育在双阳性成熟期受阻 MHC-,不变链 无CD4+T细胞，CD4+CD8-/+很少，正常NK，1.1+CD4+,CD8+正常 CD4 CD8+数量和功能正常 MHC-，2微球蛋白 无CD8+ T细胞，CD4+T细胞正常 TAP1/TAP2 TcR- 无T细胞，对结核杆菌易感性增加 P59fyn T细胞发育正常，T细胞应答缺损 IgM穿膜区 晚期CD43+B聚集，无等位基因排斥 5 CD43+细胞聚集，部分成熟B细胞出现延迟 IL2 IgG1, IgG2a，IgG2b自身抗体增加 CD40L 高IgM,无生发中心，低IL12和IFN，巨噬细胞活化受阻 CD28 IgG1，IgG2b减少,
11、转基因动物的维持,Duke University Laboratory Animal Resources Center,胚胎的冷冻保存,国家遗传工程小鼠资源库,联系人：郭仕英 联系电话：025-58641520 Email: 网址： 地址：南京市浦口区学府路12号,The Jackson Laboratory Telephone+1.207.288.5845 Fax+1.207.288.6150 Mail: The Jackson Laboratory Customer Service 610 Main Street Bar Harbor, Maine 04609-1500 U.S.A. Online:JAX Mice Online Order Request Form (secure interactive PDF) Email: orderquestjax.org,美国实验动物公司,美国实验动物公司,Charles River Laboratories, Inc. 251 Ballardvale Street Wilmington, MA 01887-1000 For General Inquiries Phone: 978-658-6000Fax: 978-658-7132 Email: ,The end,
