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1、威斯腾生物技术中心 2014.9.1,蛋白质印迹法 （western blot技术）,Western Blot介绍Western Blot一般流程Western Blot常见问题分析,Western Blot 介绍,蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治斯塔克（George Stark）。在尼尔伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的分析生物化学（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体
2、检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现己广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。,Western Blot流程,（1）贴壁细胞蛋白样品收集A 收集培养瓶或六孔板中的培养液转移至离心管中。B 加入PBS冲洗2-3遍，再将PBS转移至离心管中，离心收集细胞。C 将细胞培养瓶或六孔板置于冰上，然后将离心好的离心管中的液体小心倾尽并放置于冰中，加入含PMSF的RIPA裂解液200l于离心管中并移至对应的培养瓶中，摇晃培养瓶使裂解液与贴壁的细胞充分接触，冰上裂解30min。D 裂解结束后用细胞刮将贴壁的细胞刮下并转移至1.5 ml EP管中，再用超声破碎仪破碎细胞后，4
3、下12000rpm离心15min，吸取上层液体于新的离心管中，弃掉沉淀。,收集蛋白样品 (Protein sample preparation),分多次将细胞收至一个管中,（2）蛋白含量测定（福林-酚法 ）目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（福林-酚试剂法）、 BCA法等。1、配制BSA标准溶液：0、25、50、100、150、200、300 g/mL（用PBS配制）。样品液：取原液2 L至200 L （用PBS配制）。2、操作：先取一块新的96孔板，于630nm下测光密度值，取溶液/样品40L和E液40L，每个浓度点均作三复孔，振荡混匀。37C
4、反应10 min后，加入福林酚试剂（1:15稀释）160L，振荡混匀，37C反应30 min。630 nm下测光密度值。以标准蛋白浓度对光密度值作出标准曲线，计算待测样品蛋白浓度。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,分离胶浓度与蛋白分离范围,1、配制下层胶（分离胶）,静置1h后制上层胶（浓缩胶）,2、配制上层胶（浓缩胶）,加完后插上梳子，静置1h,(1) SDS-PAGE凝胶配制,制胶,操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。 加完分离胶后胶，加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。 灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。 分离胶充分凝固就倒去胶上层水
5、并用吸水纸将水吸干。 插梳子时要使梳子保持水平。,制胶过程注意事项：,(2) 上样与电泳 将制备好的样品溶解后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。跑上层胶，70V 35Ma/块 45 min；跑下层胶，100V 35Ma/块胶 1 h左右。,转膜(Transfer),半干转移法将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸间。 |纸|胶|膜|纸| 槽式湿转法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中。 |海绵|纸|胶|膜|纸|海绵|,转膜注意事项,滤纸、胶、膜之间不能有气泡。 滤纸、胶、膜的大小和摆放顺序。 胶和膜上要做好标记，识别正反面和上下 。 PVDF膜需
6、要100%甲醇预处理，后续操作中膜必须保持湿润。,转膜条件： 推荐：100V ，12小时；根据蛋白大小以及胶厚度的不同而不同。,转膜后检测（此步可以省略）,丽春红染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。,封闭(Blocking),将转印膜浸泡到封闭液中，将膜上没有结合蛋白质的区域结合上蛋白质，目的是使抗体与特异的蛋白质结合。,封闭液5 % TBST脱脂奶粉溶液（30ml）牛血清白蛋白溶液( BSA ),摇床上缓慢摇动封闭，室温2 h或4过夜。,Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响
7、抗体与抗原的结合。,一抗孵育 (Primary antibody incubation),把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入稀释好的一抗，室温或4在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4缓慢摇动孵育过夜。或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。 回收一抗。加入TBST液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 注：Western结果通常需要提供内参作为对照，通常可以选用Tubulin抗体或Actin抗体，进行内参检测。,二抗孵育 (Secondary a
8、ntibody inucubation),NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入稀释好的荧光二抗， 37 缓慢摇动孵育一小时。二抗需根据一抗进行选择，例如，一抗是小鼠来源的IgG，则二抗需选择抗小鼠IgG的二抗。 回收二抗。加入TBST液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。,蛋白检测 (Detection of proteins),DAB显色法,ECL显色原理：(二抗用HRP标记)反应物为过氧化物+鲁米诺，如果遇到HRP即发光，可使胶片曝光显影。,化学发光显色法(ECL ),ECL化
9、学发光显色比较常用，结果容易控制，但是被催化是灵敏度差一点 DAB显色比较灵敏，是HRP最敏感的底物,电解质-电解质可促进抗原抗体复合物的形成，因此常选用各种缓冲液做为抗体的稀释液。 酸碱度-抗原抗体反应需要适宜的pH值环境，一般为pH6.0-8.0。 温 度-温度升高可使反应加速，但温度高于56时，可导致抗原抗体的解离，甚至变性。,影响抗原抗体反应的因素,胶不平？凝胶漏液？,胶板洗刷干净 加入APS和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐,对 策,背景太高,抗体浓度过高 封闭不充分 膜没有均匀浸湿
10、 膜或者缓冲液污染 抗体与封闭剂出现交叉反应,原因,对 策,杂交前检测一抗、二抗的工作浓度 延长封闭时间或更换封闭液 转膜前用甲醇将膜完全浸湿 拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液 检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应,非特异条带多,蛋白带型条状,上样过量 样品沉淀 样品中的污染 制胶不佳,原因,对 策,降低上样量 加大样品中的SDS浓度 离心样品 确保灌胶均匀,条带模糊,蛋白样品部分变性 蛋白样品部分还原 电泳时间过长,原因,对 策,完全变性蛋白 确保加入足够的DTT或-巯基乙醇 观察指示剂染料，掌握恰当的电泳时间,哑铃型条带或 “微笑” 条带,上样体积过大导致不完全堆积 电泳过程中电场不均匀 分离胶表面不齐,原因,对 策,使用恰当上样体积 如果蛋白浓度已知，上样时确保对称 制胶时使分离胶表面水平,无条带的原因,蛋白样品制备 检查胶：考马斯亮蓝染胶 检查膜：丽春红S染色 抗体滴度太低 显色 试剂放置太久或存放条件不正确,谢 谢 ！,
