第三章 发酵工业原料及其处理

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1、第一篇 工业微生物和发酵工业原料,第三章 发酵工业原料及其处理,第一节 发酵工业原料的种类和成分第二节 淀粉水解糖的制备第三节 发酵培养基灭菌,第1节 发酵工业原料的种类和成分,一、发酵培养基中各种成分的定量 1 概念: 发酵培养基是供微生物生长繁殖和合成大量产物的培养基。 （1）要求： 有利于微生物的生长繁殖，防止菌体过早衰老； 利于产物的合成。 （2）成分种类： 碳源、氮源、无机盐、生长因子、水； 前体、促进剂、抑制剂。,1.碳源: 在发酵培养基中的含量远大于其在种子培养基中的含量。 （1）作用 提供合成细胞物质所需碳素； 提供目的产物中的碳； 合成产物的能源。 （2）种类 淀粉、淀粉水解

2、糖、糖蜜、有机酸、低碳醇、脂质、烃类。,2.氮源: 在发酵培养基中的含量因发酵目的产物不同而不同。 目的产物是否含有氮元素。 （1）分类： 有机氮源： 豆粉、花生饼粉、棉子粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、 鱼粉等 无机氮源 氨水（液氨）、硝酸盐、铵盐。,3.无机盐: 发酵培养基的必需成分之一 主要有磷、硫、铁、Mg、Zn、Co、Cu、Mn等。 4.生长因子: 为发酵培养基必不可少的组分 对量的控制要适当，如生物素亚适量法的谷氨酸发酵。 5.前体: 概念：有些化合物被加入培养基后，能够直接在生物合成过程中结合到产物分子中去，而自身的结构并未发生太大变化，却能提高产物的产量，这类小分子物质被称为前体。

3、 前体使用浓度要适当，浓度过高对菌体有毒害作用，一般采用 流加方式，减少一次加入量。,二、工业上常用作碳源的淀粉质原料 淀粉质原料含淀粉量高，而且来源广泛、价格便宜。 淀粉质原料及其水解液是发酵工业常用的碳源； 使用最广泛的淀粉质原料是工业淀粉、谷类、薯类； 工业淀粉有玉米淀粉、小麦淀粉、甘薯淀粉、马铃薯淀粉。,三、工业上常用作氮源的蛋白质类原料 发酵工业上常用的蛋白质原料主要有豆粉、花生饼粉、棉子粉、玉米浆、蛋白胨、酵母粉、鱼粉等。 黄豆粉可分为：全脂黄豆粉、低脂黄豆粉和脱脂黄豆粉。 玉米浆是用亚硫酸浸泡玉米所得的浸泡液的浓缩物（固形物含量在50%以上） 蛋白胨由各种动物组织和植物水解制备；

4、有血胨、肉胨、鱼胨、骨胨等。 酵母粉由水解啤酒酵母和面包酵母制得。 以上各种蛋白质原料均是由天然原料加工而成，成分复杂；因原料产地、加工方法、原料品种等不同，营养物质的含量也随之变化，因此对发酵有较大影响。,四、发酵培养基中的无机盐和生长因子 1.磷酸盐是某些蛋白质和核酸的组成部分；磷酸盐有缓冲作用。 2.硫酸镁镁是许多酶的激活剂，硫为含硫蛋白提供硫源。 3.钾盐、钠盐一般以磷酸盐的形式供给 4. 微量元素以有机碳氮源时可不单独添加 5.生长因子发酵工业一般以农副产品原料提供常用的有玉米浆、麸皮水解液、糖蜜、酵母水 解液等。,五、发酵生产的前体物质和促进剂、抑制剂1.前体多在氨基酸、抗生素、核

5、苷酸发酵中添加使用2. 促进剂 作用是改善细胞环境：增加渗透性、增强氧的传递速度等。 如表面活性剂、甲醇、EDTA。 3.抑制剂 作用是抑制某些途径而使代谢向所需要产物的途径转化。,第2节 淀粉水解糖的制备,一、淀粉水解糖的制备方法 葡萄糖是碳源中最容易利用的单糖， 淀粉水解后可获得葡萄糖； 淀粉质原料是发酵工业最常用的原料之一。 在工业生产上将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化，所制得的糖液为淀粉水解糖。 凡是淀粉质原料都可用于制备淀粉水解糖。 水解方法有：酸水解法、酶水解法、酸酶结合水解法。,二、淀粉酶水解制糖分两步：液化和糖化，又称为双酶水解法。 相对于化学法的酸水解法，采用专一性的酶

6、制剂作催化剂，反应条件温和，副反应较少，可提高原料的转化率和糖液浓度，改善糖液质量； 缺点是反应周期长。 （1）液化酶又称为-淀粉酶，是内切型淀粉酶，任意切开 -1,4糖苷键。 （2）糖化酶，是外切型淀粉酶，从末端依次水解 -1,4糖苷键和 -1,6糖苷键，产生-葡萄糖。,第3节 发酵培养基灭菌,一、消毒与灭菌的原理和方法,发酵采用纯种培养,只有生产菌的存在 不能有任何杂菌,要求,发酵过程中,纯种培养的必要性,杂菌污染所致的危害/不良后果（p73） 消耗营养成分； 分泌代谢产物，或改变培养液的某些理化性质，影响产物的提取分离； 大量繁殖的杂菌改变反应介质的pH，使生物反应发生异常； 杂菌有可能

7、分解产物； 染菌严重者造成“倒罐”（“颗粒无收”）或污染噬菌体，导致细胞裂解，使生产失败。,引出灭菌和消毒的必要性，杀死所有非生产用微生物。,1、灭菌与消毒 灭菌是采用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。 消毒是采用物理或化学方法杀死环境中的病原微生物，但一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌的芽孢。 消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的。,灭菌方法,其中，氧化作用是导致微生物死亡的主要依据。,1.干热灭菌法 利用高温产生的干热对微生物有氧化、蛋白质 变性和电解质浓缩引起的中毒等作用而杀灭微 生物。,微生物对干热的耐受力比对湿热强得多，因此干热灭菌

8、所需要的温度较高、时间较长。 如121oC，需过夜灭菌。,适于灭菌后要求保持干燥的物料和器具； 应用实例是灼烧灭菌。,在有水分存在时，蛋白质更易受热而凝固变性。,2.湿热灭菌法 借助蒸汽释放的热能使微生物细胞中的蛋白质、 酶和核酸分子内部的化学键受到破坏，引起不 可逆的变性，使微生物死亡。,适用于培养基和发酵设备的灭菌； 100oC，4060 min或121oC，30 min。,湿热灭菌的优缺点,优点： 1）蒸汽具有很大的潜能、放热； 2）蒸汽具有强大的穿透力； 3）蒸汽来源容易，操作费用低廉，本身无菌； 4）蒸汽输送可借助本身的压强，调节方便，技术管理容易。,缺点：设备费用高；不能用于怕受潮

9、的物料灭菌。,常用的射线：紫外线、高能量的电磁波或粒子辐射。 其中，紫外线最常用。,3.辐射灭菌法 利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。,波长260 nm（与核酸的吸收波谱一致），DNA吸收后产生变异，引起死亡； 穿透力低（不能穿透玻璃），只能用于表面杀菌。,适用于热敏感的气体或液体的灭菌,4.过滤除菌法 利用微生物不能透过滤膜而达到除菌目的。,膜滤器（最常用） 滤膜为醋酸纤维或硝酸纤维，膜孔径一般为0.010.45 m 一般，实验室采用该法对少量的液体除菌； 工业上利用小板框对抗生素等产品灭菌处理。,可用于器皿、双手、实验室和无菌室的环境灭菌，但不能用于培养基灭菌。,5.

10、化学试剂灭菌法 利用药物与微生物细胞中的成分发生反应，使蛋白质变性、酶失活。,方法： 可采用浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等方法。,常用的化学试剂： 高锰酸钾溶液、漂白粉、75%酒精溶液、过氧乙酸、甲醛、酚类、抗生素等。,二、培养基和设备的灭菌 以湿热灭菌最为普遍，效果最好。,经济、快速,通过高温和含水量使细菌蛋白质迅速变性，,同时 对培养基的营养成分也有破坏作用,控制加热温度和时间,常用121oC,2030 min。,1. 概念,致死温度：杀死微生物的极限温度。 致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间。热阻：表示为微生物对热的抵抗力的方式，指微生物在某一特定条件下（主要指温度和

11、加热方式）的致死时间。,在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。,致死温度和致死时间是衡量热灭菌的指标。,不同细菌、芽孢对热的抵抗力不同。,2. 微生物的热死定律对数残留定律,杂菌的受热致死主要是因蛋白质变性,灭菌时间的确定,属于一级反应,活的杂菌细胞在一定温度下受热致死的过程与 一级化学反应中未反应分子的减少速度类似 （存活细胞与未反应分子等价）,对数残留定律,减少速率：-dN/dt 残留菌数：N 速度常数：K,灭菌时间t的决定因素： 污染程度（No） 灭菌程度（Nt） K值,灭菌程度即残留菌数，一般采用Nt=0.001，即1000次灭菌中有一次失败。,K值,如何确定K值？,反应速度常数K值

12、：是微生物耐热性的一种特征， 它随微生物种类和灭菌温度而异。,在条件相同情况下，不同菌的K值不同 K值越小，该微生物越耐热,芽孢K值为1 min-1，营养细胞K值可达1010 min-1,t= (2.303/ K) lg(No/Nt),同一种微生物在不同灭菌温度下， K值也不相同 灭菌温度越低，K值越小,T与K值成反比,Nt=0，则t=,Nt=0.001,例题,有发酵培养基40 m3，原始污染程度为105个菌/ml，要求无菌程度为10-3个菌/批，若灭菌温度125oC使灭菌速度常数为1 min，求所需要的灭菌时间。,No=40106 105=41012 Nt=0.001 K =1 min-1,

13、t= (2.303/ K) lg(No/Nt)=(2.303/ 1) lg(41012/10-3)=20.8（min）,3. 培养基灭菌温度的选择：,灭菌温度与菌死亡的反应速度常数k关系： 阿累尼乌斯方程,k=Ae -(E/RT),k-比死亡速率常数； A-比例常数，又称为阿累尼乌斯常数； e-2.718 ； R-气体常数； E-杀死该微生物所需的活化能； T-绝对温度。,反应分子必须达到活化态才能参加反应或指获得活化能该微生物才能被杀死。,3. 培养基灭菌温度的选择：,随温度上升，微生物的死亡速率常数增加倍数要大 于培养基成分的破坏速率的增加倍数； 即杀死微生物速率的提高超过培养基成分破坏速

14、率 的增加。,灭菌过程中，微生物被杀灭的过程中也伴随着培养基成分破坏。,达到相同灭菌效果时，温度T越高，所需的灭菌时 间t越短。因此可通过提高灭菌温度，缩短灭菌的时间。,k=Ae -(E/RT),4. 影响培养基灭菌效果的因素： 除灭菌时间和灭菌温度外，还有：,培养基成分； 培养基的物理状态； 培养基的pH； 培养基中的微生物数量； 微生物细胞中的水分含量； 微生物细胞的菌龄； 微生物的耐热性； 空气排除情况； 搅拌； 泡沫。,三、发酵培养基灭菌工艺,间歇灭菌,将培养基装入发酵罐内直接通入蒸汽进行灭菌。,1、实罐灭菌,特点：不需另外的设备，操作简便，灭菌效果可靠，工业上广泛应用。,不足：升温和

15、降温的时间较长。,工艺流程,装料,2、空罐灭菌,通入饱和蒸汽于未加培养基的罐体内进行湿热灭菌。,罐压和罐温可稍高于实罐灭菌。,发酵过程中若罐染菌（尤其是芽孢杆菌）， 必须先进行空消。 结合甲醛熏消（用量为罐体积的0.001%）,灭菌结束后加大进风量，延长吹干时间,吹净 甲醛,灭菌彻底,3、连续灭菌,培养基的连续灭菌就是将配制好的培养基经过专用 的消毒设备，在向发酵罐等培养装置输送的同时进 行加热、保温和冷却而进行灭菌。,1. 灭菌温度高 可在较高温度灭菌，降低灭菌时间，减少营养破坏。 2.蒸汽负荷均衡，灭菌质量稳定 3.高产量（分消） 4.提高发酵罐利用率 5.适于自动控制，降低劳动强度,优点,四、培养基和设备、管路灭菌的条件 参考内容自学、了解,思考题,湿热灭菌有哪些优点？ 写出微生物的热阻和培养基湿热灭菌的对数残留定律； 并解释在相同温度下，为什么某菌的k值越小说明它越耐热？,t= (2.303/ K) lg(No/Ns),