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1、第三章 细胞培养的基 本方法,教学目的和要求：2学时,重点和难点： 掌握细胞培养中无菌操作技术及操作过程中需要注意哪些问题； 预防污染是无菌操作的关键。,组织培养中最重要的，也是最基本的要求就是各项操作均应从无毒害、无污染的培养环境来考虑。培养基、器皿材料、接种工具、操作环境、培养室和超净工作台等各个环节都应注意。,第一节 无菌操作技术,一、实验器具等的洗涤和材料的准备培养玻璃器具的洗涤是非常重要的。用完后应洗净，再用蒸馏水冲一遍，烘干；用合适的方法灭菌。,二、培养室和超净台的消毒（一）、无菌范畴 灭菌工作是极其重要的。对于初学者来说，首先应建立有菌和无菌的概念。有菌的范畴：凡是暴露在空气中的
2、物体，至少其表面都是有菌的。如植物表面、超净工作台的台面，未处理的工具、手等。,无菌的范畴：物理或化学处理的物体（工具、器皿、培养基等） ；健康的动植物不与外部表面接触的组织内部可能是无菌的（有时也有内生菌，但不会影响培养，也不会污染）。,（二）无菌操作室，工作前后室内清扫、拖地，以防菌在空气中流动，特别真菌孢子。使用前，室内及超净工作台紫外灯杀菌30分钟，超净工作台酒精（75%）杀菌，工作中一直吹风。,三、洗手和着装,工作服、帽子、口罩； 洗手,四、无菌操作1、点燃酒精灯，所有操作均在火焰近处并经过烧灼进行； 2、冷却后才能使用； 3、操作时，打开试管盖，要进行烧灼灭菌，但是时间要短。在火焰
3、上烧瓶口。保证容器倾斜。,4、进行操作时动作要准确敏捷，但是不宜太快，防止空气流动，增加污染的机会； 5、超净工作台上的器具和用品要摆放合理； 6、操作时器具不能触及瓶口以防止污染； 7、不要说话,接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中,正 确 错 误,整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速,正 确 错 误,防止操作带来的污染 接种过程中尽可能达到悬空要求,正 确 错 误,正 确 错 误,接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口,瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口,正 确 错 误,接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生,种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表面，而不是插
4、到培养基内部，以免供氧不足,正 确 错 误,接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形态学上端露于空气中,正 确 错 误,污染材料应及时清除，高压灭菌。菌有两种，细菌成粘液状，真菌有菌丝。 特别真菌危害极大。,五、使用超净台注意事项,1、超净台安装在清洁无尘的房间内，最好为隔离的无菌间，以免尘土过多易使滤器阻塞，降低净化效果，缩短使用寿命；,2、长期未使用或新安装的超净台使用前必须对工作台和周围环境进行清扫，再采用化学灭菌或紫外线灭菌法进行灭菌处理；,3、使用前用75酒精擦洗台面，并提前用紫外线灭菌30min。关闭紫外灯后应启动鼓风机运转几分钟后再进行培养操作；,4、净化工作区不应存放不必要的
5、物品，以保持洁净气流型不受干扰； 5、用后工作台要用75酒精擦洗，以备后面工作人员使用； 6、及时更换滤器。,条件：温度：依培养对象选择合适的温度。光照：光照时间和光照强度1培养架 放置培养物2空调 调节温度3配电板 设熔电器和开关，用以管理室内的电源4时控器 自动关灯、开灯5温度自动纪录仪,第二节 、培养,实体显微镜（解剖镜）倒置显微镜生物显微镜照相设备,对培养材料进行细胞学鉴定和研究,第三节 培养细胞的观察,1、细胞计数法（cell counting）用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞浓度的一种方法。,2、细胞生长曲线（cell growth curve）是观
6、察细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标。 横坐标为培养时间 纵坐标为细胞密度 注意：只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合观察。,3、细胞分裂指数指分裂期细胞在全部细胞中所占的百分率，用以表示细胞的增殖旺盛程度。一般要计算和观察1000个细胞中的细胞分裂相数。,4、细胞贴壁率细胞贴壁率又称接种存活率，用于观察贴壁附着生长细胞，主要反映细胞的生存能力和部分底物材料的相容性。,5、细胞周期细胞周期：一个细胞的分裂生长周期时 间。倍增时间：指在对数生长期细胞数量增加一倍所用的时间，这一时间内一般有些细胞参与分裂有些细胞可能不参与分裂，有些可能分裂两次或数次，但细胞总数量增加1倍。,第四节 细胞培养中
7、常用的染色方法,活体染色体外活体染色就是在体外条件下用某种染色剂（即活体染料）对活的组织或细胞进行染色，而不影响活细胞的生命活动的一种方法。利用这种方法，可以对培养物进行染色观察，染色后的培养物还可以继续进行培养。,1、活体染料的类别,碱性染料,酸性染料,中性红，甲基兰,刚果红，台盼蓝,第五节 细胞培养的污染与检测,污染是组织培养的大敌，避免污染的发生。 污染一般包括微生物污染（细菌、真菌、支原体和病毒）、化学物（影响细胞生存的非细胞所需的化学成分）、细胞（非同种的其他细胞）。,1、污染途径,A. 空气措施：减少空气流动 B. 器材措施：消毒彻底，洗刷干净，定期消毒,C. 操作措施：严格进行无
8、菌操作，避免交叉感染 D. 组织样本很难避免,2、污染对培养细胞的影响及检测,影响：细胞生长缓慢、分裂相减少、细胞变得粗糙、细胞轮廓增强、重者细胞停止增殖、分裂相消失、细胞质中出现大量堆积物、细胞变圆或崩溃从瓶壁脱落。,A. 细菌的污染及检测取悬液培养，培养液颜色变黄，混浊。 B. 真菌的污染及检测可见菌丝，显微镜下可观察到链状排列的菌珠，散在细胞周围和细胞之间生长。,C. 支原体污染常见而棘手，与细胞共存。借助显微镜、电镜、DNA荧光处理法等观察。 D. 病毒的污染及检测,E. 细胞交叉污染及检测操作不当、共同培养导致不同种类之间发生混乱，细胞生长特征、形态发生变化。 有效防止细胞的交叉污染： 1）在进行多种细胞培养时器具要严格区分； 2）器具不要触及培养瓶口以免把细胞带到培养瓶中； 3）保存细胞，污染后可以复苏。,3.污染的预防,防止污染，预防是关键。 1）、培养操作前的准备超净台保持清洁；使用消毒后的器皿。,2）、培养操作时的注意事项见无菌操作的注意事项。,4、污染的排除,1、使用抗生素； 2、加温处理； 3、动物体内接种除菌法； 4、巨噬细胞吞噬法,思考题,1、细胞培养时如何预防污染？ 2、列举无菌操作的注意事项。,谢谢！,
