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1、第二组,大家早上好！,原理特征,逆流色谱法（CCC）：基于样品在两种互不混溶的溶剂之间的分配作用，溶质中各组分在通过两溶剂相过程中因分配系数不同而得以分离。这是一种不用固态支撑体的全液体色谱方法。,用很长的软管绕制成的色谱柱内不加入任何固态支撑体或填料。用此体系的上层或下层作为色谱过程的固定相，首先将其注满管柱内，然后让此管柱作特定的旋转运动，用由此形成的离心力场来支撑住柱内的液态相。,根据被分离混合物的理化特性.选择某一种有机/水两相溶剂体系或双水相溶剂体系，此体系可以是二元的或多元的。,若用溶剂体系中的另一层作为流动相，带着混合样品由泵的压力推入分离管柱，样品就会穿过两个液相对流的整个管柱
2、空间，各个组分就会按其在两相中的分配系数分离开来。,液滴逆流色谱(DCCC)旋转小室逆流色谱(RLCC)离心逆流色谱法高速逆流色谱法(HSCCC),逆流类型,DCCC (液滴逆流色谱): 是在逆流分溶法基础上创建的色谱装置，可使流动相呈液滴形式在固定相间交换，促使溶质中各组分在两相之间进行分配，达到分离效果。,液滴逆流色谱(DCCC),缺点：流动相流速低，每小时只有十几毫升；分离过程 长，一般需要几十小时才能完成一次几个组分的分离,旋转小室逆流色谱（RLCC）,用中心有一小孔的聚四氟乙烯园盘将分离柱管分隔成若干连通的小空间，再将若干根这样的柱管排列在圆形转盘架上，柱管之间用聚四氟乙烯管串联起来
3、。溶剂通过旋转密封接头进出这组分离柱管。,柱管以一定的转速和倾角绕转盘中心轴转动。流动相进入第一个小室后，取代其中原已注满的固定相的位置，直到流动相液面达到圆盘上小孔的水平时，流动相就会穿过小孔进入下一个小室，并依次从一根柱管进入另一根柱管。随着流动相逐步穿过各个小室，带动样品在各个小室的两相间分配。,离心逆流色谱法：仪器工作的时分离柱要绕中心轴在设备中高速转动，因为高速旋转产生的离心力可使两相剧烈地反复混合分层，实现快速高效的分离。,离心逆流色谱,非行星式逆流色谱仪：主要包括分离柱室螺旋式和非螺旋管式，主要是匣盒式离心逆流色谱仪。行星式逆流色谱仪：分离柱几乎全是利用聚四氟乙烯管绕成的螺旋线圈
4、。,高速逆流色谱法（HSCCC）,HSCCC是一种不用任何同态载体的液液色谱技术，其原理是基于组分在旋转螺旋管内的相对移动而互不混溶的两相溶剂间分布不同而获得分离，其分离效率和速度可以与HPLC相媲美。,高速逆流色谱,线圈300ml,高速逆流色谱技术的优点,1、不用固态载体的高效液-液分配色谱技术 2、不存在样品的不可逆吸附，理论回收率100% 3、样品负载能力强，制备量大，重现性好 4、操作成本低，无制备柱消耗，后续投入较低 5、可采用广泛的溶剂体系和多样性的操作条件 6、操作简单，无需太多样品前处理,应用 实例,例1 低速逆流色谱分离制备栀子黄色素中的藏花素,藏花素具有广谱抗癌活性，对白血
5、病、卵巢癌、结肠癌、横纹肌肉瘤和软组织肉瘤等都具有较强的抑制作用，而对正常细胞几乎无毒性,两相溶剂系统由叔丁基甲基醚-正丁醇-乙腈水(2：2.5：1：5，vvvv)组成，以上相为固定相下相为流动相。在转速为50 rmin和流速为5mLmm的条件下，从5 g栀子黄色素粗样中分离得到2.47 g藏花素，纯度为96.8。,取样溶解,进样,洗脱,收集,反向洗脱,正交实验,固定两相的浓度、组成，研究不同转速、流动相流速对固定相保留率的影响,固定相保留率越高对分离越有利，因此最佳转速选为50rmin。流动相的流速不但影响分离时间，而且也会对分离度产生一定的影响。在其他参数相同的条件下，流速越大，分离时间越
6、短，但是固定相保留率越小，分离度就越小。因此流速选择要尽可能保证固定相保留率和分离度综合实际分离情况，本实验最佳流速选为5 mL min。,例2 高速逆流色谱纯化白藜芦醇的研究,白藜芦醇具有多种生物学活性及药理作用， 它具有抗癌、抗菌、抗氧化、预防心脏病、降血脂和抗诱变等作用，特别是具有很强的抗肿瘤活性及对心血管系统的作用! 已经成为食品及医药行业研究的热点。,实验步骤： 虎杖粉碎提取过滤浓缩预处理除杂, 乙醚沉淀浓缩分离出大黄素高速逆流色谱分离收集相应波峰的流出液干燥白藜芦醇成品,虎杖中白藜芦的提取 采用有机溶剂回流提取和超声波强化提取法。其中超声波强化提取法时间很短，可以大大缩短生产周期，
7、且不需加热，节能高效,虎杖的提取液预处理除杂由表1可以看出乙醚沉淀法效果较好除去了大量杂质24.9%,高速逆流色谱分离提纯考察了两种不同的溶剂系统，包括氯仿：甲醇：水=4:3:2 及乙酸乙酯：乙醇：水=10:1:10 其他条件影响不大。结果，第二种溶剂系统不能将白藜芦醇及大黄素等其他杂质逐个分开，效果不好，第一种溶剂系统相对较好。因此，选择溶剂体系为氯仿：甲醇：水=4:3:2分离条件采用转速850r/min, 流速2ml/min,进样量5ml提取液,紫外检测波长280nm, 保留率31.4%,溶解将分离纯化所得出的白藜芦醇用甲醇溶解，在紫外色谱仪上进行扫描，并同标准样品进行对比，得到的谱图与标
8、准品谱图相比基本一致,高效液相色谱测定经高效液相色谱测定，利用高速逆流色谱分离 纯化所得白藜芦醇得率为0.186% 纯度大于96%,得出结论本实验最佳工艺条件：白藜芦醇除杂：乙醚沉淀法 溶剂体系：氯仿：甲醇：水=4:3:2 转速850r/min 流速2ml/min 进样量5ml提取液,例3 夏天无生物碱的高速逆流色谱分离纯化,夏天无具有活血通络，行气止痛的功效，主要用于治疗中风偏瘫、跌扑损伤、风湿性关节炎、坐骨神经痛等.夏天无的主要活性成分为生物碱类化合物，如原阿片碱、比枯枯灵和四氢巴马亭等。建立主要活性成分的分离制备方法，对夏天无药材及其产品的质量控制十分必要。,样品的制备,夏天无3.0 k
9、g,粉碎过筛,加乙醇，回流,过滤,合并滤液,减压回收乙醇得浸膏,用800 mL lHCl超声溶解,过滤,石油醚萃取脱脂,脱脂水溶液加稀氨水搅拌调节pH 9.5,沉淀,过滤,得夏天无总生物碱21.3 g，冷藏保存备用,两相溶剂系统及样品溶液的制备,正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:2:8,V/V)，分液漏斗分液,上相加5mmolL三乙胺作固定相,下相加5 mmolL HCI作流动相,常规HSCCC二次分离溶剂系统为正己烷一乙酸乙酯一甲醇-水(1：0.8：1.1：1，VV)，按比例置于分液漏斗中，充分振荡，静止分层，分取上下相。样品用上相和下相各5 mL溶解。,加碱,3.0g夏天无总生物碱，超声
10、振荡溶解,分离及鉴定 HSCCC分离过程固定相以9 mLmin流速注满高速逆流色谱仪的螺旋管，转速为800 rmin,样品注入进样圈(常规HSCCC二次分离过程需溶剂系统平衡后进样)，同时流动相以2 mLmin流速泵入。开启检测器和记录仪，检测波长为254 nm，根据色谱图收集各色谱峰组分。HPLC分析及结构鉴定夏天无生物总碱和高速逆流色谱分离各组分用HPLC分析。WatersC18色谱柱,检测波长为280 nm；流动相为乙腈-乙酸乙酸钠缓冲溶液(70：30，VV，pH 5.0)，流速1.0mLmin，进样量10L。,溶剂的选择,正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水体系下相加10 mmolL浓HCl为溶
11、剂系统，虽然出现平台峰，但样品的分离效果不佳；采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:2:8，v/v)上相加10 mmolL三乙胺，下相加10 mmolL浓HCl为溶剂系统，分离效果明显改善。但通过HPLC分析，分离效果仍不理想,用降低保留酸碱浓度的方法，取得了较为满意的分离效果(如图)。取夏天无生物碱3.0g，采用溶剂系统正己烷乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:2:8,VV)，上相加5 mmolL三乙胺，下相加5 mmolL浓HCl)进行分离.在358484min得到的3比枯枯灵和化合物4四氢巴马亭的组成的混合物762 mg.,结论：溶剂系统正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1:0.8:1.1:1vv)
12、的分配系数大小适合分离,例4 高速逆流色谱分离纯化防风中 升麻素苷和5-D-甲基维斯阿米醇苷,防风为伞形科防风属多年生草本植物,用于治疗感冒头疼、风湿痹痛、风疹瘙痒和破伤风等。2005年版中华人民共和国药典中，将升麻素苷和5-D-甲基维斯阿米醇苷作为防风的指标成分。现代药理研究表明，升麻素苷和5-D-甲基维斯阿米醇苷具有解热、镇痛、抗炎、抗血小板聚集等多种功效悼3 J。因此建立相关成分的高效分离纯化方法具有重要意义。,样品的制备防风根经45烘干至恒重粉碎，过0.9mm孔径筛。取100 g防风粉末用500 mL甲醇室温浸提过夜(12 h)，过滤，重复用400 mL甲醇提取滤渣2次(每次8 h)，
13、合并提取液，减压蒸馏，得浸膏5.2g，放置冰箱内备用。,分配系数的测定取2 mg粗提物于5 mL试管中，分别加入预先达到分配平衡的两相溶剂系统上、下相各2 mL，剧烈震荡l min后静置分层，分别取上、下相用HPLC检测，上相峰面积为A1，下相峰面积为A2，分配系数K=A1A2。,两相溶剂系统及样品溶液的制备在分液漏斗中配制y(乙酸乙酯)：V(正丁醇)：V(水)=2:7:9两相溶剂系统，充分振摇后静止过夜。上相为固定相，下相为流动相，使用前分别用超声波脱气30 min。取316 mg防风粗提物，溶于12 mL的上下相(1:1，VV)混合溶剂系统中，震荡使之完全溶解，备HSCCC进样。,HSCC
14、C分离过程用最大流速将上相泵入并充满分离螺线管循环水浴并将温度设定为30 开启检测器并按选定的转速启动主机待流动相从管柱出口流出且基线稳定后将样品溶液由进样圈注入。管柱出口处的流出物经紫外检测器检测并由色谱工作站记录，根据色谱图手动收集各色谱峰组分并经HPLC检测纯度。,HPLC色谱条件Diamonsil C18色谱柱(200 mm4.6 mm i.d,5 pm)；流动相：甲醇-水；梯度洗脱，010 min，30一45甲醇；1015 min，45一65甲醇；1525 rain，65一100甲醇;柱温：30；检测波长254 nm；流速1.0 mLmin；进样量20L。,实验步骤,讨论溶剂系统的选
15、择,不同的溶剂系统具有不同的上、下相之比,粘度、极性、密度等性质差异均对相同的成分产生不同的溶解、分配能力,形成分配系数的差异,对分离效果产生一定的影响,结论：选择乙酸乙酯-正丁醇-水2:7:9系统做溶剂,结论与展望,逆流色谱技术操作简单易行，无需对样品进行复杂处理，可在线检测出峰；可以和灵敏度高的检测技术联用，比如与质谱、电子电离质谱、化学电离质谱、快速原子轰击质谱、热喷雾质谱等的联用；应用广泛、无需固体载体，产品纯度高等优点。 不足的是消耗溶剂过多，检测限低，灵敏度较差。尽管如此，随着液相色谱的迅猛发展，HSCCC将不断创新，日臻完善。,参考文献,1戴德舜,王义明,罗国安,等.高速逆流色谱
16、进展J.分析化学评述与进展,2001,29(5):586-591 2刘迪,陈雪峰,宋晓宇,等.高速逆流色谱技术应用现状J.食品与机械,2006,22(2): 3黄秋霞,周如意,国大亮,则玉璇.高速逆流色谱法及其在药物纯化领域中的应用J.齐鲁药事,2010,19(10):616-619 4郑卫,逆流色谱技术在抗生素分离纯化中的应用J.中国抗生素杂志,2005,30(3):180-186 5赵淑杰,韩梅,韩忠明,李彦颖,杨利民.高速逆流色谱分离与鉴定鹿药中黄酮类化合物J.分析化学研究简报,2009,37(9):1354-1358 6沈平壤.高速逆流色谱(HSCCC)技术与色谱指纹谱J.中成药,2010,23(5):311-315 7曹学丽,等.高速逆流色谱技术在药物研究开发中的应用J.世界科学技术-中医药现代,2009,9(1),
