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1、层析技术,主要内容,概述 层析技术分类 层析技术的原理及具体应用 结果分析(色谱图) 定性和定量检测方法,重点内容,层析的概念 层析技术的分类(按分离机制) 分配系数K 空间排阻色谱和离子交换色谱的应用,概述,1906年由俄国植物学家Tsweet创立植物色素分离见图示,图示,固定相CaCO3颗粒 流动相石油醚,层析，就是利用样品中各组成成分的不同物理化学性质的差异，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，由于各组分随流动相前进的速率不同，从而把它们分离开来的技术。,a. 固定相，可以是一种固体、凝胶或固定化的液体，由某种支持基质所支撑。 b. 层析床，把固定相填入一个玻璃或金属柱中，或者
2、薄薄涂布一层于玻璃或塑料片上, 或者吸附在醋酸纤维纸上。 c. 流动相，起溶剂作用的液体或气体，用于协助样品平铺在固定相表面及将其从层析床中洗脱下来。 d. 运送系统，用来促使流动相通过层析床。 e. 检测系统，用于检测试管中的物质。,层析系统的必要组分有：,当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。,两相及两相的相对运
3、动构成了色谱法的基础,层析法是根据物质的理化性质不同而建立的分离分析方法。它具有分辨率高、灵敏度高、选择性好、速度快等特点，因此适用于杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析。近年来，已成为生物化学及分子生物学常用的分析方法。在医药卫生、环境化学、高分子材料、石油化工等方面也得到了广泛的应用.,用途（举例说明）,分析混合物的问题，苯系物包括苯、甲苯、二甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、奈、乙苯等，共存在于同一体系时，用什么方法可以测定其中一种或几种组分的含量？ 层析最大的特点就是能将一个复杂的混合物分离为各个有关的组分，并逐个检测出来。能较好的分离物理常数相近、化学性质类似的同系物和
4、异构体。,层析法的分类,分类：1按两相分子的聚集状态分：,流动相 固定相 类型,2、按固定相的几何形式分类,柱色谱法 纸色谱法 薄层色谱法,(1).柱色谱法 (column chromatography),将固定相装在一金属或玻璃柱中，或是将固定相附着在毛细管内壁上做成色谱柱，试样从柱头到柱尾沿一个方向移动而进行分离的色谱法。,(2).纸色谱法（paper chromatography）,利用滤纸作固定液的载体，把试样点在滤纸上，然后用溶剂展开，各组分在滤纸的不同位置以斑点形式显现，根据滤纸上斑点位置及大小进行定性和定量分析。,(3).薄层色谱法 (thin-layer chromatogra
5、phy, TLC),将适当粒度的吸附剂作为固定相涂布在平板上形成薄层，然后用与纸色谱法类似的方法操作以达到分离目的。,续前,3按分离机制分：,层析法的原理,一、分配系数K 二、基本类型色谱法的分离机制及应用,一、色谱过程是被分离组分在两相中的“分配”平衡过程.,以吸附色谱为例见图示 吸附 解吸再吸附 再解吸 反复多次洗脱被测组分分配系数不同 差速迁移 分离,图示,分配系数的微小差异吸附能力的微小差异 微小差异积累较大差异吸附能力弱的组分先流出；吸附能力强的组分后流出back,在不同类型的色谱过程中, 色谱的分离机制各不相同，分别形成吸附平衡、分配平衡、离子交换平衡和渗透平衡等.,续前,分配系数
6、K（平衡常数）：指在一定温度和压力下，组分在色谱柱中达分配平衡后，在固定相与流动相中的浓度比（色谱过程的相平衡参数）,K为热力学常数，与组分性质、固定相性质、流动相性质及温度有关；实验条件固定，K仅与组分性质有关,每个组份在各种固定相上的分配系数K不同； 试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础； 试样一定时，K主要取决于固定相性质； 选择适宜的固定相可改善分离效果； 一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢； 某组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出。,物质分离和K值的关系,二、基本类型色谱法的分离机制及应用,（一）吸附色谱法 （二）分配色谱法 （三）空间排阻色谱法 （四）离子交换
7、色谱法(五) 亲和色谱法,（一）吸附色谱法( adsorption chromatography ),要求：固定相吸附剂（硅胶或AL2O3）具表面活性吸附中心 分离机制：见图示,利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差别而使之分离的色谱法称为吸附色谱法。,图示,分离机制：各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离,吸附解吸再吸附再解吸无数次洗脱分开back,（二）分配色谱法( partition chromatography ),要求：固定相机械吸附在惰性载体上的液体流动相必须与固定相不为互溶载体惰性，性质稳定，不与固定相和流动相发生化学反应 分离机制
8、见图示,利用固定液对不同组分分配性能的差别而使之分离的色谱法称为分配色谱法。,图示,分离机制利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离,连续萃取过程 back,（三）空间排阻色谱法,要求：固定相多孔性凝胶流动相水凝胶过滤色谱流动相有机溶剂凝胶渗透色谱 分离机制见图示,应用脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这个过程称为脱盐。本法操作简便、快速, 蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原,制备注射用水。,测定高
9、分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗脱后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。,（四）离子交换色谱法,要求： 固定相离子交换树脂 流动相
10、水为溶剂的缓冲溶液 被分离组分离子型的有机物或无机物,阳离子交换树脂 RSO3-H+ + X+ RSO3-X+ + H+,图示,分离机制：依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力）不同而实现分离 back,应用1. 水处理 离子交换层析是一种简单而有效的去除水中的杂质及各种离子的方法。一般是将水依次通过H 型强阳离子交换剂，去除各种阳离子及与阳离子交换剂吸附的杂质；再通过OH 型强阴离子交换剂，去除各种阴离子及与阴离子交换剂吸附的杂质，即可得到纯水。再通过弱型阳离子和阴离子交换剂进一步纯化，就可以得到纯度较高的纯水。,2. 分离纯化小分子物质 离子交换层析也广泛的应用于无机离子、有机酸、核苷酸
11、、氨基酸、抗生素等小分子物质的分离纯化。例如，对氨基酸的分析，使用强酸性阳离子聚苯乙烯树脂，将氨基酸混合液在pH 2-3上柱。这时氨基酸都结合在树脂上，再逐步提高洗脱液的的离子强度和pH，这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来，可以进行分离鉴定。,3. 分离纯化生物大分子物质 离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生物大分子的一种重要手段。由于生物样品中蛋白的复杂性，一般很难只经过一次离子交换层析就达到高纯度，往往要与其它分离方法配合使用。使用离子交换层析分离样品要充分利用其按带电性质来分离的特性，只要选择合适的条件，通过离子交换层析可以得到较满意的分离效果
12、。,（五）亲和层析利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技术。具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体、DNA与互补DNA或RNA、酶与它的底物或竞争性抑制剂、激素（或药物）与它们的受体、维生素和它的特异结合蛋白、糖蛋白与它相应的植物凝集素等。,可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含有混合组份的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出，然后改变流动相成份，将结合的亲和物洗脱下来。亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。
13、,亲和层析纯化过程简单、迅速，且分离效率高。对分离含量极少又不稳定的活性物质尤为有效。但本法必须针对某一分离对象，制备专一的配基和寻求层析的稳定条件，因此亲和层析的应用范围受到了一定的限制。亲和层析可用于纯化生物大分子; 稀溶液的浓缩；不稳定蛋白质的贮藏；从纯化的分子中除去残余的污染物；分离核酸是亲和层析应用的一个重要方面。,1. 抗原和抗体 利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低，用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离，而亲和层析则是一种非常有效的方法
14、。将所需蛋白质作为抗原，经动物免疫后制备抗体，将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂，就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。另外金黄色葡萄球菌蛋白A（Protein A）能够与免疫球蛋白G（Ig G）结合，可以用于分离各种Ig G。,2. 生物素和亲合素生物素（biotion）和亲合素（avidin）之间具有很强而特异的亲和力，可以用于亲和层析。生物素和亲合素的亲和力很强，洗脱通常需要强的变性条件，可以选择biotion的类似物，如2-iminobiotin、diiminobiotin等降低与avidin的亲和力，这样可以在较温和的条件下将其从avidin上洗脱下来。,另外，可以利用生物素和亲
15、合素间的高亲和力，将某种配体固定在基质上。例如将生物素化的胰岛素与以亲合素为配体的琼脂糖作用，通过生物素与亲合素的亲和力，胰岛素就被固定在琼脂糖上，可以用于亲和层析, 分离与胰岛素有亲合力的生物大分子物质。生物大分子用生物素标记后不改变其生物活性，这使得生物素和亲合素在亲和层析分离中有更广泛的用途。,3. 维生素、激素和结合转运蛋白 通常结合蛋白含量很低，用通常的层析技术难于分离。利用维生素或激素与其结合蛋白具有强而特异的亲和力而进行亲和层析则可以获得较好的分离效果。4. 激素和受体蛋白 激素的受体蛋白属于膜蛋白，利用去污剂溶解后的膜蛋白往往具有相似的物理性质，难于用通常的层析技术分离。但去污
16、剂溶解通常不影响受体蛋白与其对应激素的结合, 因此, 利用激素和受体蛋白间的高亲和力而进行亲和层析是分离受体蛋白的重要方法。目前已经用亲和层析方法纯化出了大量的受体蛋白，如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、吗啡、胰岛素等多种激素的受体。,5. 凝集素和糖蛋白 用适当的糖蛋白或单糖、多糖作为配体也可以分离各种凝集素。-D-甲基甘露糖苷或-D-吡喃葡萄糖苷的糖蛋白，麦胚凝集素可以特异的与N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰神经氨酸结合，用于血型糖蛋白A、红细胞膜凝集素受体等的分离。洗脱时只需用相应的单糖或类似物，就可以将待分离的糖蛋白洗脱下来。,6. 辅酶 核苷酸及其许多衍生物、各种维生素等是多种酶的辅酶或辅助因子，利用它们与对应酶的亲和力可以对多种酶类进行分离纯化。例如, 固定的各种腺嘌呤核苷酸辅酶，包括AMP、cAMP、ADP、ATP、CoA、NAD+、NADP+等等应用很广泛，可以用于分离各种激酶和脱氢酶。7. 多核苷酸和核酸 利用poly-U作为配体可以用于分离mRNA以及各种poly-U结合蛋白。以DNA作为配体可以用于分离各种DNA结合蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶等多种酶类。,
