《质粒dna的小量快速提取》由会员分享，可在线阅读，更多相关《质粒dna的小量快速提取（33页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、质粒DNA的小量快速提取,第五次实验 质粒DNA的小量快速提取制备,目的：为了证实所得的转化子的重组质粒DNA是否确实由载体质粒与目的基因组成，已排除其它可能方式的连接。 常用鉴定方法：小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析；互补；插入失活；杂交筛选。 正常重组DNA：经酶切电泳，可获得5.4kb的载体和1.1kb的目的基因。 错误基因插入：不能酶切或片段大小不同。 反向连接（出现在平端连接）：不被酶切或片段大小不同。 载体自我环化：没有小片段。,一、基因工程简介,概念：应用酶学的方法, 在体外将各种来源的遗传物质 （ 同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA)与载体DNA接合成一具
2、有自我复制能力的DNA分子( 复制子replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA),过程,特点1.连续性2.微量操作3.防止污染化学试剂外源DNA生物公害,载体包括质粒、病毒、噬菌体等。 质粒的特点细菌细胞染色体外的共价的闭合的环状的dsDNA分子，能自主的自我复制并表达，并能稳定的遗传给子代。,二、碱变性法的原理,主要利用变性和复性的差异分离染色体DNA和质粒DNA分子染色体DNA 质粒DNA pH12.6 完全变性 不完全变性双链完全解开 双链局部解开pH4.
3、8 不能复性 复性 NaAc高盐 缠连网络结构 溶解沉淀,其他杂质的去除,细菌细胞破坏后，细胞内容物释放出来，除了DNA外，还有RNA、蛋白质、细胞器碎片、可溶性杂质如糖、有机酸碱及盐分等。这些都必须通过相应的技术手段去除。 碱变性中所用的NaOH-SDS溶液还可沉淀大分子RNA及部分蛋白质。 酚、氯仿可去除蛋白质。 无水乙醇、异丙醇可沉淀核酸，去除可溶性杂质。两者的区别？ RNase可降解RNA。,操作步骤：见P100,关键词EP管、EP离心机、微量移液器（加样枪）、Tip头（枪头）、震荡器等,溶液1,溶液2,溶液3,-20, 10min,12000rpm,10min,质粒DNA的酶切,一、
4、原理,限制性核酸内切酶 定义：识别dsDNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶 作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统, 限制外源DNA, 保护自身DNA。 分类：、(重组DNA技术中常用)、 ,类酶作用特点,能在特殊位点识别和切断dsDNA，识别序列4-6bp，具有回文结构 （180度旋转对称结构） Hind 产生5粘性末端,Sst ,产生3粘性末端,GTC CAG,Hind,GTCGAC CAGCTG,GAC CTG,+,平端切口,酶的命名,以酶所来源的微生物的学名进行命名。 第一个大写字母是来源菌的种名的第一个字母；接着的两个小写字母，是属名的头两个字母；第
5、四个字母或数字代表株系；最后的罗马数字代表在同一菌株中发现的酶的编号（通常按发现的先后顺序） 如在Haemophilus influenzae d株中发现的第三种限制酶（），,被称作Hind 。,酶活性单位,指在限定条件下（温度、Buffer），1hr消化1ugDNA的酶量称为一个酶单位（unit）。 实际工作中，为保证消化完全，1ugDNA的消化需要3-5个单位的酶，反应时间也要适度延长，通常是反应过夜。,酶切反应系统的设计,酶通常保存在50%的甘油中（？），使用时甘油浓度必须小于5%，故酶至少稀释10倍。 实际酶的用量应是理论用量的3-5倍。 Buffer通常是10，使用时稀释10倍。 总
6、反应体积20-50ul，不足用d3H2O补足。 注意加样顺序。 混匀反应物。,二、操作步骤：见P101-102,可在酶解系统中同时加入RNase进行RNA降解。 注意控制反应的条件。,酶切体系的设计,质粒DNA 10ul（10ug),Hind III (20U/ul) 2ul,10 x 缓冲液 2ul,三蒸水 6ul,_ 总体积 20ul,DNA片段的琼脂糖凝胶电泳,一、原理,分离原理：电荷效应、分子筛效应 显色原理：溴化乙锭（EB）本身在紫外光照射下能发出荧光，当其与DNA分子结合后，荧光强度大大增强，与DNA含量成正比。但本身是强烈的致癌物。Gold view和双链DNA分子结合，在紫外光
7、激发下，发出绿色荧光。,二、影响DNA电泳的因素,DNA分子的大小、形态迁移率：超螺旋线性开环 电流强度过高会降低分辨率，通常 琼脂糖浓度分离一定大小的DNA片段,需采用合适的琼脂糖浓度,见P103表。,三、电泳分子量标记物与点样液,电泳分子量标记物又称marker，为已知片段长度的DNA片段所组成，用于估算未知DNA片段的大小。如我们所用的DNA/Hind的marker，由七条已知片段大小的DNA片段所组成，依次是23.7、9.46、6.75、4.26、2.26、1.98、0.58（kb）。 点样液：含有40%的蔗糖和指示剂溴酚蓝。,四、操作步骤：见P102,关键操作：点样,marker,plasmid,RE digested,.; mkojnonjonj.;,
