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1、基因工程的基本操作程序,原核细胞的基因结构,原核细胞基因,编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的合成，即能够编码蛋白质,非编码区（调控序列）：位于编码区上游和编码区下游的DNA序列，虽不能指导有关蛋白质的合成，但有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等,原核细胞的基因结构,RNA聚合酶的作用是催化DNA转录为RNA。它能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并与DNA分子的一条链为模板合成RNA。,真核细胞的基因结构,与原核细胞比较，真核细胞基因结构的主要特点是： 编码区是间隔的、不连续的。也就是说，能够编码蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的
2、序列分隔开来，成为一种断裂的形式。 其中，能够编码蛋白质的序列叫做外显子，一般不能够编码蛋白质的序列叫做内含子。,真核细胞的基因结构,真核细胞基因,编码区 （间隔、不连续）,外显子：能编码蛋白质的DNA序列 内含子：不能编码蛋白质的DNA序列,非编码区：与原核生物具有相似功能的启动子、终止子,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,基因的种类,（1）编码蛋白质的基因：包括结构基因和调节基因。 （2）没有转译（转录翻译）产物的基因：如rRNA基因和tRNA基因。 （3）不能转录的DNA片段：如操纵基因。,启动子与终止子,启动子是在非编码区内紧靠转录起点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能引导RNA
3、聚合酶与正确的基因部位结合，使转录从起点开始，沿编码区进行。 终止子是在非编码区内紧靠转录终点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。,基因工程的基本操作流程,获取目的基因,从基因文库中获取 利用PCR技术扩增 利用化学方法人工合成,基因组文库和部分基因文库,基因组文库,部分基因文库,目的基因的获得,从基因文库获得 基因文库 利用PCR技术扩增 人工合成,基因组文库 部分基因文库(如cDNA),已知序列,未知序列,寻根问底 （1）为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？,提示：构建基因文库是获取目的基因的
4、方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。,（2）基因文库如何构建？,将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶， 将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后，将这些DNA 片段
5、分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个 受体菌都含有了一段不同的DNA片段。也就是说，这个群体 包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。,如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 反转录产生的 多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个 受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA 文库。 两种基因文库的主要区别如下表所示：,基因组文库和部分基因文库,cDNA合成过程,第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。 第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。 第三
6、步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。,目的基因的mRNA,单链DNA (cDNA）,双链DNA (即目的基因),反转录,合成,1）反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法(化学合成) ：,人工合成：,2、利用PCR技术扩增目的基因,PCR技术原理 及反应过程,原理： DNA双链复制,反应过程：,1、加热至9095 目的基因
7、DNA解链 2、冷却至5560 ， 引物结合到互补DNA链 3、加热至7075 ， 热稳定DNA聚合酶从 从引物起始互补链的 合成,步骤二：基因表达载体的构建,1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。 2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。 3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,表达载体的组成 目的基因 启动子 终止子 标记基因,基因工程载体的构建需要考虑哪些因素,（1）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用
8、于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。 （2）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。 （3）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌
9、和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,步骤三：目的基因导入受体细胞-转化,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。,直接导入法有电击、显微注射、直接吸收、基因枪等方法。 （1）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。 （2）显微注射法：利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。 （3）直接吸收法：把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸收。 （4）基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主细胞中。 间接导入法常用的载体是质粒、噬菌体、科斯质粒。 （1）质粒是细菌染色体DNA以外的环状双链DNA分
10、子，它能自我复制，也可整合到细胞染色体DNA中与其一起表达。质粒通常还含有标记基因，这可以从细胞的表型特征来识别。 （2）噬菌体是一种细菌病毒，其环状双链DNA可以作为目的基因的载体。 （3）科斯质粒是一种杂种质粒，含有质粒和噬菌体的部分顺序，很适合用作真核生物基因的载体。,1.将目的基因导入植物细胞,其他方法：基因枪法，花粉管通道法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴
11、加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,2.将目的基因导入动物细胞,显微注射法,3.将目的基因导入微生物细胞,大肠杆菌细胞最常用的转化方法是:,1）将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。 2）使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。 3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。,步骤四：目的基因的检测与鉴定,四、目的基因的检测与鉴定,1、检测与鉴定的目的,目的基因进入受体细胞后，是否可以稳定维持 和表达其遗传特性,检测目的基因是否插入了转基因生物的染色体DNA上,2、,检测目的基因是否转录出了mRN
12、A,检测目的基因是否翻译成蛋白质,另外：个体生物学水平的鉴定,思考：检测mRNA 是否合成，可以用分子杂交的方法吗？,#检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗原抗体杂交,#个体生物学水平的鉴定,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。,受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？,若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。,前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。,细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达
13、产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,思考：1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是： （1）
14、生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；,（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,2根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?,要选择
15、合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物； 要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。,3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,4.-珠蛋白是动物血红
16、蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？,寻根问底：,（1）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。 （2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。 （3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。 （4）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取-珠蛋白。,归纳: 基因工程的基本操作程序,获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、显微注射法 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译,基因操作的基本步骤,寻根问底 （1）为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？,
