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1、,第八章 核酸的体外扩增与 基因芯片技术 主讲教师： 熊伟 副教授/博士,第一节 聚 合 酶 链 反 应 Polymerase Chain Reaction,聚 合 酶 链 反 应 (Polymerase Chain Reaction,PCR) 1983年,美国PE Cetus公司的Kary Mullis建立了PCR技术,使人们能够通过试管内的数小时反应将特定的DNA片段扩增数百万倍, Kary Mullis因此获1993年度诺贝尔化学奖.,Kary Mullis(1985) 发明过程 Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到: “这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA片段的方
2、法是在不可想象的情况下，即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。 发展过程： 开始使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段，该酶不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得自动化。,PCR发展速度 惊人，没有一种技术能与之相比 引用论文最多、应用范围十分广泛 1993年度诺贝尔化学奖：Mullis，与开创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大籍英国科学家Michael Smith共获,原理 类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在D
3、NA聚合酶作用下得以延伸。 这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。,参与DNA复制的物质,底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP 聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，简写 为 DNA-pol 模板(template) : 解开成单链的DNA母链 引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子：,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,一、基本工作原理,（一）原理： 双链DNA通过高温变性解离成互补单链DNA
4、 变性 与一对寡核苷酸引物（5， 3）降低温度退火 DNA加热变性+引物慢慢冷却使其结合，形象地称为退火 适温延伸5/3引物形成新链变成4条链DNA 延伸 第二轮：变性退火延伸 呈指数增长 理论值：一轮一倍 10轮 210=1000倍 20轮 220 30 轮 230 理论 模板扩增30轮 1ng-1g 实际 模板扩增30轮 1ng-10g,模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs 含Mg2+ 的缓冲液,二、PCR体系基本组成成分,1 . Taq DNA聚合酶： 水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶 53DNA聚合酶活性； 无35外切酶活性， 35
5、轮0.25%错配，与原始模板有差别； 最适聚合酶温度72，选择72延伸,pfu DNA 聚合酶,耐热 53DNA聚合酶活性 35外切酶活性 精确度：pfu Taq 但pfu扩增效率通常比Taq酶略差 文献报道：Taq+pfu 会起到较好效果,2.引物 人工合成短寡核苷酸15bp-30bpTm=55-60， Tm值要相近 设计原则： (P62) （1）靠近5上游Primer与双链DNA正链相同 3下游Primer与双链DNA正链互补，与负链相同 正链5 3 上游Primer 下游Primer 负链 3 5 例如： IL-3正链 5GCTCCATGACCCAG- GCGATCTTTTGAGTCCA
6、A 3 负链3CGCTAGAAAACTCAGGTT 5 上游： 与其相同 下游： 先写出相应负链35然后倒过来53 所以负链Primer：5-TTg gAC TCA AAA gAT CgC -3,（2）Primer 本身不要出现内部互补序列 形成loop环，内部二级结构 如： GGGTCGATTCCTACCCATGC （3）注意减少Primer间互补序列 导致2个Primer形成dimer 一般不要超过3个互补bp 如：CCCATGC ATGGAGTC : : : : : : : : GGGTCTA TCAGTAAGC,修饰 如：32P、生物素、荧光素，不影响其效果 突变： AGCTCCATG
7、ACCCAG 5CGCTCCATGACCCAG 3 注意：绝不可以在3端进行上述改造 DNA聚合酶是53聚合，若3端改造不能互补不能延伸,（4）Primer 5 末端可修饰、突变:,3.模板： 可选：DNA mRNA逆转录cDNA DNA包括： 质粒 噬菌体 染色体DNA 较小 较大 目的gene是单拷贝 变性较易 变性较难 非常大，变性难 模板用量 Plasmid:lng Chromosome:300-500ng 注意： 防止交叉污染,模板可以是DNA，也可以是RNA。RNA逆转录成cDNA再进行正常的PCR循环。 标本取材： 病原体：病毒、细菌、真菌等 病理生理：细胞、血液、尿液等 法医：
8、血斑、精液、毛发,4.dNTP： 四种脱氧核苷酸，基本原料 终浓度：50M 注意：不稳定，保存时间长会失效,5.Mg2+ TaqDNA聚合酶作用时需要Mg2+ 不同的酶需不同Mg2+ Taq：较少，Mg2+ 对反应影响很大，0.5-1.5mM终浓度 pfu：Mg2+ 2-3mM，dNTP、primer用量约增加一倍,（1）变性温度：94-95 Templete：GC比例高、长度很长，则变性T （2）退火：温度越高，扩增特异性越好 取决于Tm值：Tm退火T； Tm退火T 若Tm较高，可使退火和延伸在同一温度 （3）延伸： 1000nt-1min 一般：4060s,6.温度和时间：,三、PCR的基
9、本反应步骤,变性 95C,延伸 72C,退火 Tm-5C,PCR反应的步骤, 在微量离心管中，加入适量的缓冲液，微量的模板 DNA，人工合成的两个DNA引物，四种脱氧单核 苷酸（dNTP），一种耐热的多聚酶和Mg2+。 将上述溶液加热，使模板DNA在高温下（如95） 变性，双链解开为两条单链； 然后降低反应温度，使两条引物在低温下（55） 分别与两条模板互补退火，形成局部双链；, 再升高反应温度至中温（72），此时多聚酶以dNTP为原料，以两引物为复制的起点，在两条模板上合成新的DNA子链(延伸)。 如此重复改变反应温度，即高温变性、低温退火和中 温延伸三个阶段。,PCR实验中应注意的事项,防
10、止样品的污染和结果的假阳性： 分装试剂，减少重复取样 采用一次性吸头 无菌操作 实验对照：阳性对照、阴性对照、试剂对照,（一）目的基因的克隆 （二）基因的体外突变 （三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA序列测定,四、PCR的主要用途,PCR 技术的应用,一、基础研究中的应用 二、临床研究中的应用,PCR技术在临床疾病的诊断中的用途,一、PCR检测性病病原体 二、PCR检测肝炎病毒 三、PCR检测消化道、呼吸道致病菌 四、PCR检测寄生虫 五、PCR在遗传性疾病诊断中的应用 六、PCR在肿瘤疾病诊断中的应用,PCR技术在基础研究中的应用,一、目的基因的克隆 RT-PCR、Nested-PC
11、R 、RACE 与反转录反应相结合,直接从组织和细胞的mRNA获得目的基因片断 利用特异性引物从基因组DNA或者cDNA获得已知目的基因片断 利用随机引物从cDNA或者基因组文库中克隆基因 二、体外突变 嵌和、缺失、点突变,PCR扩增产物的检测,琼脂糖凝胶电泳 溴化乙锭（嵌入）染色 紫外光检测 分子量参照,PCR产物电泳,五、几种重要的PCR衍生技术,（一）反转录PCR技术 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术,Real-time PCR,利用实时荧光定量PCR的原理，对DNA靶分子的起始拷贝数进行定量的核酸检测系统。该方法精确、灵敏、污染途径小。是国际公认的核酸分子定量的标准方法。 它
12、是在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 它已逐渐代替了Northern blot 以及RT-PCR技术。,实时PCR技术原理,PCR引物,实时PCR技术原理,引物之间一段带有标记寡核苷酸链，称作探针,报告基团,淬灭基团,无荧光信号产生,能量,完整的探针：5端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移）,变性 (95C),退火 (60C),延伸 (72C),?,53外切酶活性 将探针5端连接的荧光基团从探针上切割下来,实时(Real-time) PCR的优点,实时PCR反应可以在PCR扩
13、增进展过程中监测到每一个循环后PCR产物的积聚情况,而且能对反应产物进行自动化定量分析 与传统PCR反应相比,实时PCR不需要进行凝胶电泳分析,这样可以减少污染的机会,降低假阳性结果,基 因 文 库 Gene Library,第 二 节,基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库 (cDNA library),基因文库 (gene library),是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。,基因组DNA文库,cDNA 文 库,第 三 节 基 因 芯 片 技 术,Biological Chip Technology,生物芯片,生物芯片（biochip）是
14、近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA及其他生物组分的准确、快速与大信息量的检测。,生物芯片的分类,(1) DNA芯片(Gene chip, DNA chip, DNA microarray) (2) 蛋白质芯片(Protein chip) (3) 芯片实验室(Lab-on-a-chip),基因芯片：是指将大量探针分子固定在物体表面，与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，进而获取样品分子的数量和系列信息。 它以其可同时、快速、准确地分析数以千计的基因组信息而显示巨大威力。 目前，基因芯片已经应用于基因表达检测、寻找新基因、杂交测序、基因突变等许多方面。,
