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1、在基因水平诊断疾病 Gene Diagnosis,朱 敏 2006. 11. 13,第一节 基因诊断的概念及常用技术,患者临床表现：中医的望闻问切与西医的影像学检查 细胞形态、生化检测及免疫学检验：生命活动的结构和物质基础,Concept of Gene Diagnosis,第一节 基因诊断的概念及常用技术,基因诊断的概念,基因诊断的出现：1976年加州大学华裔科学家 Kan YW用核酸分子杂交首次对一例珠蛋白生成障碍性贫血进行诊断,狭义:在基因（DNA或RNA)水平，用PCR、核酸杂交、基因重组、基因芯片等各种分子生物学技术检测特定基因存在与否、结构变异和表达状态的过程，对疾病作出诊断。 V
2、ogue references：forensic medicine, identification of biological species, etc.,基因诊断的概念,第一节 基因诊断的概念及常用技术,基因诊断的概念,与传统诊断的区别：直接以病理基因（致病基因、疾病相关基因和外源性病原生物基因等）为分析对象，即对待诊生物材料某一（些）特定基因进行分析判断。,第一节 基因诊断的概念及常用技术,第一节 基因诊断的概念及常用技术,Concept of Gene Diagnosis,Essential basis of gene diagnosis 遗传物质改变：一是DNA或RNA水平变化，如病毒
3、基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高等；二是基因结构变化即突变，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活等。,Essential basis of gene diagnosis 疾病或个体表型的本质 生物遗传学基本规律 分子生物学技术与方法,第一节 基因诊断的概念及常用技术,Concept of Gene Diagnosis,Hybridization and PCR are basic techniques used in gene diagnosis,（一）应用核酸分子杂交可进行基因的特异识别和分析核酸杂交的基本原理：Denature vs Anneal (
4、Renature),第一节 基因诊断的概念及常用技术,核酸变性和复性理论：（1）双链DNA分子在某些理化因素作用下解旋，条件恢复后又可恢复其双螺旋结构；（2）具有互补碱基序列的异源核酸单链之间同样可按碱基互补配对原则通过氢键结合为双链。,核酸分子杂交和PCR扩增是基因诊断的基本技术,核酸杂交的基本过程：Preparation of Samples and ProbesPrehybridization and HybridizationDetection and Analysis of the Result,第一节 基因诊断的概念及常用技术,核酸分子杂交和PCR扩增是基因诊断的基本技术,1.制备
5、合适的探针是核酸杂交用于基因诊断的关键What is a probe? 标记的已知序列核酸片段，包括 DNA, cDNA, RNA, Oligonucleotide,第一节 基因诊断的概念及常用技术,针对具体情况选择合适的探针序列是基因诊断准确、特异、简便、可靠的基础。,第一节 基因诊断的概念及常用技术,核酸分子杂交和PCR扩增是基因诊断的基本技术,2.不同形式的核酸分子杂交可用于不同的诊断目的,Southern blotNorthern blotdot hybridizationreverse dot hybridizationFISH: fluorescence in situ hybri
6、dization,2.不同形式的核酸分子杂交可用于不同的诊断目的,Southern blot一般过程：提取DNA 限制性内切酶消化DNA以产生特定长度的片段凝胶电泳分离（DNA分子有其独特的限制性酶切图谱，所以经酶切消化和电泳分离后可在凝胶上形成特定的区带）变性处理DNA转印到膜上并使其牢固结合预杂交及杂交结果检测与分析,Hybridization and PCR are basic techniques used in gene diagnosis,（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术Principle of Polymerase Chain Reaction,第一节 基因诊断的概念及常
7、用技术,PCR原理示意图,PCR是在试管内利用DNA聚合酶催化的反应反复进行同一段DNA片段合成的过程,（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术,N=N0(1+E）nN-扩增产物的量; N0-起始靶DNA分子数E-扩增效率；n-循环次数。 理论上，从一个模板分子起始，经过n次聚合反应后可合成2n个分子。如进行30轮扩增，则可合成出230，即109个待检分子；对一段500bp的DNA片段来说，约等于1 g 。,pg,g,（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术,PCR在基因诊断中的作用从极少样品即可扩增出肉眼可见的产物。放大待诊信号，提高检测灵敏度,（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术,PC
8、R及其衍生技术 直接运用PCR扩增：异常缺失与存在 PCR产物的限制性酶谱分析（PCR-RE)和限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP)RFLP: Restriction Fragment LengthPolymorphism,（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术,PCR及其衍生技术PCRRFLP：通过PCR将包含待测位点的DNA片段扩增后，用识别相应位点的限制性核酸内切酶水解，根据所产生限制性片段的数量和长度作出诊断。用于已知突变位点的验证性诊断,（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术,PCR及其衍生技术 3. PCR-等位基因特异性寡核苷酸探针斑点杂交(PCR-ASO，PCR-D
9、B)ASO: Allele Specific Oligonucleotide1). wild probe vs mutant probe 2).已知突变的验证性检测3).可区分纯合子和杂合子,（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术,PCR及其衍生技术 4. PCR产物的反向点杂交分析（PCR-RDB ） RDB: Reverse Dot Blot 固定探针,（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术,PCR及其衍生技术 5. PCR-单链构象多态性分析（PCR-SSCP)将PCR产物变性为单链后进行非变性（中性）聚丙烯酰胺凝胶电泳，单个核苷酸的改变即可造成DNA单链构象的改变，进而导致电泳速率
10、变化，从而检测出基因突变。 1）单链核酸碱基-构象-电泳速率 2）中性聚丙烯酰胺凝胶电泳,PCR-SSCP分析原理示意,（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术,PCR及其衍生技术 6. PCR-变性梯度凝胶电泳分析（PCR-DGGE） Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术,PCR及其衍生技术 7. 甲基化特异性PCRMethylation specific PCR, MS-PCR 模板甲基化处理：Na2SO3 C-U 需设计特异性甲基化引物G:C/A:U,3 GGACGTAGA5 非甲基化引物 5-CCTGC
11、ATCT- GCGCTAGGC-3 3-GGACGTAGA-CGCGATCCG-55GCGCATGGC 3,3 AAACATAAA 5 甲基化引物 5-UUTGUATUT-GCGCTAGGC-3 3-GGACGTAGA-AUGUGATUU-5 5TACACATAA 3,3 GGACGTAGA5 5-CCTGCmATCT- GCGCTAGGC-3 3-GGACGTAGA - CGCGATCmCmG-55GCGCATGGC 3,3 AAACATA AA5 5-UUTGCmATUT- GCGCTAGGC-33-GGACGTAGA -UGUGATCmCmG-55 ACACATA AC 3,若存在甲基化
12、位点,（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术,PCR及其衍生技术 8. 靶核酸的定量分析Q-PCR, Quantitative PCR基本原理：PCR指数扩增规律N=N0(1+E）n,PCR扩增有限性-平台期及平台效应（plateau effect）,PCR扩增的平台效应,PCR及其衍生技术 8. 靶核酸的定量分析（1）测定PCR产物量：梯度（系列）稀释法：先对已知量的靶DNA进行梯度稀释（类似于比色）灰度扫描法,（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术,例：PCR产物定量,PCR及其衍生技术 8. 靶核酸的定量分析（2）极限稀释法 基本依据：PCR扩增的有效起始模板分子数为104106个,
13、（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术,PCR及其衍生技术 8. 靶核酸的定量分析 （3）非竞争性对照法 基本依据：同时扩增靶序列和内标序列（扩增效率相似） 如看家基因（house keeper) 用于RT-PCR进行表达分析,（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术,PCR及其衍生技术 8. 靶核酸的定量分析（4）竞争抑制法 需制备标准参照核酸,（二）PCR技术是基因诊断的一种基础技术,PCR及其衍生技术 8. 靶核酸的定量分析（5）荧光标记探针法分析：安全、简便快捷、多重检测,荧光定量PCR实时 (real time)PCR,Hybridization and PCR are basic
14、 techniques used in gene diagnosis,（三）DNA序列测定是最直接、最准确的基因诊断技术,第一节 基因诊断的概念及常用技术,例：四色荧光自动测序分析结果,病例SOX9基因HMG box内发生单碱基置换突变R178L(GT)，如图2所示，左侧正常对照第225位碱基为C，而该患儿为A（反义链中）,例：序列分析用于基因诊断研究,Hybridization and PCR are basic techniques used in gene diagnosis,（四）DNA芯片技术是应用前景广阔的基因诊断技术（DNA chips),第一节 基因诊断的概念及常用技术,生物芯
15、片（biochip &bioarray)技术：根据生物分子间特异性相互作用，将生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质等各种生物成分的高通量快速检测分析。疾病诊断芯片个性化用药芯片,例：基因芯片杂交结果,二. 基因诊断有其独特的优点,第一节 基因诊断的概念及常用技术,高特异性：诊断目标 高灵敏度：分子生物学方法 结果稳定可靠：核酸的化学本质 早期诊断性：分子遗传学规律 应用广泛性：疾病与非疾病检查,第二节 基因诊断策略,在分子发病机制水平上对不同疾病的区分,诊断策略各不相同,第二节 基因诊断策略,不同的基因诊断策略,致病基因检测,连锁遗传标志检测,基因表达定量分析,表型相关的系列基因克隆,Commonly used Techniques,Southern印迹杂交 限制性酶谱分析 限制性片段长度多态性分析 寡核苷酸探针杂交 PCR及其衍生技术 DNA芯片技术,第三节 基因诊断的应用前景,第三节 基因诊断的应用前景,1.杂交基础上的RFLP分析 2.PCR及其衍生技术 3.芯片阵列杂交,
