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1、蛋白质分子量测定的方法,凝胶过滤法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法沉降法（超速离心法）,凝胶过滤层析,应用 a. 分离蛋白质 b. 脱盐 c. 蛋白质分子量的测定,原理 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。,由于不同排阻范围的葡聚糖凝胶有一特定的蛋白质分子量范围，在此范围内，分子量的对数和洗脱体积之间成线性关系。因此，用几种已知分子量的蛋白质为标准，进行凝胶层析，以每种蛋白质的洗脱体积对它们的分子量的对数作图，绘制出标准洗脱曲线。未知蛋白质在同样的条件下进行凝胶层析，根据其所用的洗脱体积，从标准洗脱曲线上可求出此未知
2、蛋白质对应的分子量。,内水体积Vi 外水体积Vo 柱床体积Vt 洗脱体积Ve Vt=Vo+Vi+Vg Ve=Vo+KdVi Kd=(Ve-Vo)/Vi,优点： a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析柱可反复使用 凝胶的类型： Sephadex: 交联葡聚糖 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶,器材：层析柱、部分收集器、核酸蛋白质检测仪 、记录仪,凝胶及柱的选择,返回,凝胶的处理及装柱 凝胶干粉的溶胀（热溶胀）、浮选、抽气、装柱、蓝色葡聚糖检查、平衡 装
3、柱时要注意操作压。,装柱的两种方法： a.手工操作1/3床体积水加入少许凝胶积起1-2厘米凝胶床打开出水口连续缓慢加入凝胶 b.电动搅拌下的装柱法（如图4-9）,样品上柱 分析用量：柱床体积的12% 制备用量：柱床体积的2030% 洗脱收集 部分收集器、核酸蛋白检测仪 凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰,装柱示意图,返回,核酸蛋白检测仪及记录仪（正面）,核酸蛋白检测仪及记录仪（背面）,返回,核酸蛋白检测仪,返回,记录仪,返回,部分收集器,部分收集器,返回,返回,Kd=0 Kd=1 01,SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 测定蛋白质相对分子质量,Polyacrylamide
4、Gel Electrophoresis ，PAGE,实验原理,SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法，。 1在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。 2在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），SDS是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此时，蛋白质分子的电泳
5、迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。,3. 当蛋白质的分子量在15000200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程： 1gMr =KbmR式中：Mr为蛋白质的分子量；K为常数；b为斜率；mR为相对迁移率。在条件一定时，b和K均为常数。若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。,一、PAG 的 组成,PAG是由丙烯酰胺（acrylamide，Acr）单体和N，N-亚甲双丙烯酰胺（N，N，N，N-methylene bi
6、xacrylamide，Bis）交联剂通过自由基聚合而成的一种多孔三维网状结构。 Acr + Bis- 多孔三维网状结构,（1）丙烯酰胺结构式,（2）亚甲双丙烯酰胺,二、PAG 的 聚 合,需要催化剂氧化还原系统作用，使Acr单体带有游离基，从而与Bis进行聚合。,（一）化学聚合：AP-TEMED系统,过硫酸胺(NH4)2S2O8（Ammonium persulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。,AP在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶。 TEMED的游离碱基能促进AP的形成
7、SO42- 。 注意： TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条件下聚合分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合,（二）光聚合：核黄素-TEMED系统,核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或紫外光）分解，其黄素部分被还原成无色型，但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。 注意： 分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。,三、PAG的浓度与孔径的关系,PAG孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单体的浓度决定。可以根据要
8、分离物质分子的大小，选择合适的单体浓度。 Acr/Bis：2040 完全透明且有弹性；10 很脆，易碎，不透明；100 糊状不成形，易破碎。,凝胶总浓度T100ml凝胶溶液中含有Acr和 Bis的总克数。 T=（a+b）/m100%T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。,CBis占单体与交联剂总量的百分比。C=b/（a+b）100%当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小。,四、不 连 续 PAGE,按具体操作分 垂直板形电泳圆盘电泳,按凝胶系统的均匀性分 连续PAGE不连续PAGE,分 离 原 理,1. 浓缩效应 1）凝胶层的不连续
9、性两层凝胶T与C不同孔径不同浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。,2）缓冲液离子成分的不连续性 甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3带负电，朝正极移动，进入浓缩胶（pH6.7），甘氨酸解离度（）很小，有效迁移率（M ）很低，移动速度较慢，称为慢离子。 HCl 是强电解质，=1，Cl-有效迁移率大，移动速度快，称快离子。 蛋白质（pI6.0）带负电荷，有效迁移率介于两者之间。,pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液,甘氨酸,HCl,蛋白质,样品胶,浓缩胶,分离胶,样品,低电导区,3）pH值的不连续性为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率，必须使浓缩胶与分
10、离胶之间pH值有所区别。,3.分子筛效应与电荷效应进入分离胶后，Gly-成为快离子分离胶只有电荷效应和分子筛效应，根据各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分离,仪器、原料和试剂,仪器：垂直板型电泳槽；直流稳压电源；50或100l微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；烧杯；吸量管；常头滴管等。 原料：低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.51mgml-1样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。 试剂：（1）分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液 PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。（2）浓缩胶缓冲液（Tris-HC
11、l缓冲液 PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。,（3）30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺（Acr） 30g及N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4保存。（4）10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4贮存。（5）10%SDS溶液：SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。（6）1%TEMED；,（7）10%过硫酸铵（AP）：现用现配。（8）电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液
12、PH8.3）:称取Tris 6.0g, 甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 用无离子水溶解后定容至1L。（9）样品溶解液：取SDS 100mg，巯基乙醇0.1mL，甘油1mL，溴酚蓝2mg，0.2mol/L，pH7.2磷酸缓冲液0.5mL，加重蒸水至10mL（遇液体样品浓度增加一倍配制）。用来溶解标准蛋白质及待测固体。（10）染色液：0.25g考马斯亮蓝G-250，加入454mL 50%甲醇溶液和46mL冰乙酸即可。（11）脱色液：75mL冰乙酸，875mL重蒸水与50mL甲醇混匀。,五、PAGE 的 特 点,1.具有分子筛效应，分辨率高 2.样品不易扩散，用量少，灵敏度可达10-6g 3
13、.化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲水基团 4.凝胶不带电荷，消除了电渗现象 5.机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透明 6.网孔可调节,注意事项,1. 不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。包括：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是21,000，但SDS-凝胶电泳测定的结果却是35,000。因此，最好至少用两种方法来测定未知样品的分子量
14、，互相验证。,2有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。,沉降法（超速离心法）,沉降系数（S）是指单位离心场强度溶质的沉降速度。S也常用于近似地描述生物大分子的大小。蛋白质溶液经高速离心分离时，由于比重关系，蛋白质分子趋于下沉，沉降速度与蛋白质颗粒大小成正比，应用光学方法观察离心过程中蛋白质颗粒的沉降行为，可判断出蛋白质的沉降速度。根据沉降速度可求出沉降系数，将S带入公式，即可计算出蛋白质的分子质量。,习惯上把每分钟4,000转（r/min,g）的离心机称为低速离心机;每分钟20,000 （r/min,g）转的离心机称为高速离心机,这类离心机有冷冻装置。每分钟20,000 （r/min,g）转以上的离心机称为超速离心机.,密度梯度离心,
