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1、微生物检验技术,第八章 分枝杆菌属细菌检验,刘 垣,目 录,第一节、结核分枝杆菌 第二节、麻风分枝杆菌 第三节、非典型分枝杆菌,分枝杆菌属是一类细长略弯曲的，有分枝生长趋势的杆菌。 本属细菌的主要特点是细胞壁含有大量脂质，因此不易着色，若经加热或延长染色时间而着色后能抵抗3%（强脱色剂)盐酸乙醇的脱色，故又称抗酸杆菌。,分枝杆菌属共性,缓慢生长菌迅速生长菌不能培养菌,麻风分枝杆菌,龟脓肿分枝杆菌群 偶发分枝杆菌 ,分枝杆菌属,结核分枝杆菌 牛分枝杆菌 非洲分枝杆菌 坎纳分枝杆菌 田鼠分枝杆菌 卡介苗 鸟分枝杆菌复合群 堪萨斯分枝杆菌 戈登分枝杆菌 ,迅速生长分菌（Runyon IV群）,光产色
2、菌 （Runyon I群） 暗产色菌 （Runyon II群） 不产色菌 （Runyon III群）,分枝杆菌属分类,第一节、结核分枝杆菌核分枝杆菌简称结核杆菌，是引起结核病的病原菌。对人致病的主要有人型、牛型和非洲型分支杆菌。其中人型结合分支杆菌的发病率最高。结核分枝杆菌经多途径感染，侵入全身多个器官，但以肺结核为最多见。结核分枝杆菌通过呼吸道、消化道和破损的皮肤粘膜进入机体，侵犯多种组织器官，引起相应器官感染，其中以肺结核最常见,三大传染疾病全球三大传染疾全球疾全球三大传染疾病,爱滋病（AIDS） 结核病（TB） 疟疾（Malaria）,结核病近年来发病成上升趋势，已成为危胁人类健康的严重
3、的全球性重大公共卫生问题,结核分枝杆菌复合群中结核分枝杆菌感染的发病率最高，约占90%,案例,患者，女，19岁。就诊时主诉：近一个多月来咳嗽，痰中带有血丝，无胸痛，但又明显乏力，消瘦，食欲不振，自觉午后微热，盗汗。查体：体温38.2，慢性病容。实验室检查：白细胞8x109/L，血沉70mm/h。X射线透视：右肺尖有多发性小斑片状阴影，边缘模糊。去清晨咳痰进行抗酸染色，镜下可见红色略长微弯的杆菌。 请问：1.患者可能患何种疾病？引起本病的病原体是什么？2.应做哪些微生物学检查已确诊？,知识链接,结核病至今仍为重要的传染病。据WHO报道，每年约有800万-1000万新病例发生，至少有300万人死于
4、该病。我国建国前死亡率达200-300人/10万，居各种疾病死亡原因之首，建国后人民生活水平提高，卫生状态改善，特别是开展了群防群治，儿童普遍接种卡介苗，结核病的发病率和死亡率大为降低。但应注意，世界上有些地区因艾滋病、吸毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因，发病率又有上升趋势。,一、生物学特性,1.形态与染色菌体细长略弯曲，呈单、分支状、束状、索状排列的杆菌。无芽胞、无鞭毛、有荚膜。革兰染色阳性，但不易着色。常用萋尼抗酸染色后菌体呈红色。,萋尼氏抗酸性染色法染色，菌体染成红色,荧光染料金胺O染色，在荧光下菌体呈橘黄色,2.培养特性,馋:专性需氧,营养要求高（L-J培养基） 懒:生长温度35
5、,生长缓慢,18小时繁殖一代 丑:液体培养基呈粗糙皱纹状菌膜生长,固体培养基上形成形似菜花样典型菌落,3、生化反应 1）生化反应不活泼。不发酵糖类。 2）热触酶试验对区别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌有重要意义。结核分枝杆菌大多数触酶试验阳性，而热触酶试验阴性；非结核分枝杆菌则大多数两种试验均阳性。 3）与牛分枝杆菌的区别在于结核分枝杆菌可合成烟酸和还原硝酸盐，而牛分枝杆菌不能。,“三耐三不耐” 对某些理化因子的抵抗力较强： 耐干燥 耐酸碱 耐染料 湿热 紫外线 酒精,4.抵抗力,不耐受,典型形态多形性 R型菌落S型菌落 有毒无毒（卡介苗） 抗结核药敏感耐药,5、变异性,卡介苗：是有毒力的牛型结
6、核分枝杆菌在甘油、胆汁和马铃薯的培养基中经13年230次传代而获得的减毒变异株,脂质：磷脂索状因子蜡质D硫酸脑苷酯 蛋白质荚膜,1、致病物质 尚未发现产生内外毒素及侵袭性酶，主要由菌体成分导致的炎症和免疫损伤引起病变,主要致病物质,二、临床意义,2.所致疾病,2、所致疾病 结核分枝杆菌通过呼吸道、消化道和破损的皮肤粘膜进入机体，侵犯多种组织器官，引起相应器官感染，其中以肺结核最常见。 结核分支杆菌可经淋巴-血液播散，引起脑结核、肾结核、结核性胸膜炎等,3.免疫性,抗体无保护作用，临床辅助诊断有意义。细胞免疫发挥重要抗感染作用TB菌的感染率很高，发病率却较低。抗结核的免疫称为有菌免疫，菌体及其成
7、分消失，免疫力也随之消失,4、结核菌素试验 结核菌素即结核杆菌蛋白质，目前常用结核菌素制剂是纯蛋白衍生物（PPD） 1）原理：结核菌素试验是应用结核菌素进行皮肤试验来测定机体对结核分枝杆菌是否能引起超敏反应的一种试验 2）试验方法与意义：受试者前臂掌侧皮内注射PPD5U，4872h后，观察结果。,3）结果及意义：红肿硬结超过5mm者为阳性，15mm为强阳性，对临床诊断有意义。若PPD-C侧红肿大于BCG-PPD侧为感染。反之，BCG-PPD侧大于PPD-C侧，可能系卡介苗接种所致。 4）用途：选择卡介苗的接种对象和测定接种效果；辅助诊断婴幼儿结核病；在流行病学中，作为调查人群感染结核杆菌的一个
8、指标；测定肿瘤患者的细胞免疫功能。,结核菌素试验,纯蛋白衍生物(PPD)，是用三氯醋酸沉淀结核分枝杆菌培养滤液后的纯化物。注入皮内后如受试者已感染结核，则结核菌素与致敏淋巴细胞特异性结合，形成迟发型超敏反应性炎症,根据注射部位是否出现红肿判断结果5mm为阴性5mm为阳性,三、微生物检查,1、标本采集：根据病变部位不同采集不同的标本。常见标本为痰、尿、胸腹水等。 1）痰：留取清晨第一口痰3-5ml。合格的痰标本应使患者深吸气后，由肺部深处一干咳痰、血痰或黏液痰为合格标本。用WHO推荐的国际通用螺旋盖痰瓶，或用密封塑料盒、蜡纸盒收集后送检。2）其他：无菌抽取脑脊液、胸水、腹水及关节液等盛无菌试管送
9、检。脑脊液标本静置后，表面可有细薄凝块，取凝块作涂片或接种培养,临床标本涂片检查 分离培养 HPLC 分子鉴定 免疫学鉴定直接涂片 集菌涂片 处理标本或无污染标本染色 液体培养基 固体培养基 动物试验（L-J培养基） 抗酸 金胺O 35 涂片镜检仪器培养 7天生长 7天生长快速生长菌 慢生长菌 初步鉴定抗酸染色 菌落特点鉴定试验 药敏试验,2、检验程序,3、检验方法 （1）抗酸染色镜检 1）直接涂片薄涂片：0.01ml，10mmX10mm,厚涂片：0.1ml，20mmX15mm 2）集菌涂片：将标本浓集后再涂片，提高阳性检出率沉淀集菌法；漂浮集菌法 （2）荧光染色镜检：用金胺O染色，在暗背景下
10、，抗酸杆菌发出荧光（优点：简便、快速、视野覆盖面大和阳性率检出高）,结核分枝杆菌痰涂片抗酸染色（1000）,（3）分离培养 1）培养基选择：通常使用的固体培养基有改良罗氏（L-J）培养基、小川培养基、米氏7H10和7H11，液体培养基有米氏7H9和苏通氏培养基。 2）标本的前处理：前处理的目的：一是杀死杂菌，二是液化标本。常见的方法： 40g/LNaOH法：1份痰+2份40g/LNaOH溶液，35水浴消化15-30分钟，震荡2-3次，3000r/min离心15min，弃上清，沉淀物接种 4%H2SO4法：多用于尿标本的前处理，1份标本+2-4倍4%H2SO4，室温20min，震荡2-3次，30
11、00r/min离心15min，弃上清，沉淀物接种 胰酶-苯扎溴铵法,3）接种与培养 取碱处理过的标本，接种于酸性罗氏培养基斜面上 酸处理过的标本则接种在改良罗氏培养基斜面上 4）结果： 3天内有菌落生长，可报告非分枝杆菌生长。 7天内发现菌落生长者，经过抗酸染色证实后可报告快速生长抗酸杆菌。7天以后发现菌落生长者，经过抗酸染色证实后可报告抗酸杆菌生长。 满8周后仍未见菌落生长者可报告培养阴性。 （4）鉴定：依据生化反应鉴定 （5）动物实验 （6）其他诊断技术,抗酸染色（1000）结果报告, 0300视野 12条300视野 19条/100视野2 19条/10视野3 19条/每个视野4 9/每个视
12、野,第二节、麻风分枝杆菌 麻风分枝杆菌是麻风病的病原菌。 麻风是一种慢性传染病。 主要表现为皮肤、粘膜和神经末梢的损害。 晚期可侵犯深部组织和器官，形成肉芽肿,1、形态与染色 较结核杆菌粗而短，抗酸染色阳性，呈束状或团状排列，革兰阳性，无鞭毛、荚膜和芽胞。典型细胞内寄生菌，可形成麻风细胞（即有麻风杆菌存在、呈泡沫状的细胞）2、培养特性：目前不能人工培养，可用动物犰狳（qiu yu）接种建立模型。,一、生物学特性,二、临床意义,传染源：麻风患者 传播途径：直接接触、飞沫传播 易感人群：多为免疫缺陷个体 3种临床类型:1)瘤型麻风：传染性强且病情严重，细胞免疫功能缺陷而体液免疫正常。在皮肤和黏膜下
13、形成结节性红斑，称为麻风结节。面部结节融合可呈“狮面”状。2）结核样型麻风3）界线类综合征,根据临床表现、免疫病理变化和细菌检查结果等将麻风分为瘤型、结核样型、界线综合征两种病型,结核样型麻风患者手部病变体征,第三节、非典型分支杆菌 非典型分枝杆菌分为光产色菌（I群）、暗产色菌（II群）、不产色菌（III群）和速生菌（IV群）4群。广泛分布在自然界，致病性较弱，可寄居与人体。当机体抵抗力低下时，可导致肺内、外或淋巴结类似结核的病变。特点 结核分枝杆菌 非典型分支杆菌 菌落特征 粗糙、颗粒状 光滑或粗糙 菌落颜色 乳白色或米白色 黄色或橘黄色 耐热触酶试验 - + 中性红试验 + - 索状因子
14、+ +/- 豚鼠致病性 + -,本章小结,分枝杆菌属的细菌因其细胞壁富含脂质，经加温或延迟染色时间后能抵抗一定浓度盐酸乙醇的脱色作用，故称抗酸杆菌。该属细菌培养时专性需氧，营养要求特殊，大多数生长缓慢，其中的麻风分枝杆菌目前尚不能人工培养。该属细菌中临床最常见的是结核分枝杆菌，该菌经萋尼抗酸染色后呈红色，用荧光染料金胺O染色后，在荧光显微镜下菌体发出黄绿色荧光。结核分枝杆菌常用罗琴培养基进行培养，该菌在罗琴培养基上生长缓慢，一般24周才能形成肉眼可见菌落，菌落外观类似“菜花样”；在液体培养基中生长较为迅速，一般12周即可生长，常形成表面菌膜，有毒力菌株可呈束状生长,结核分枝杆菌典型生化特征表现
15、为烟酸累积试验阳性、还原硝酸盐为亚硝酸盐、触酶阳性。该菌不被T2H抑制、吡嗪酰胺酶阳性，而牛结核分枝杆菌正好相反。结核分枝杆菌易发生变异，卡介苗是其减毒活疫苗。该菌对理化因素有较强抵抗力，耐干燥、耐一定浓度酸碱和孔雀绿或结晶紫等染料，但对乙醇、紫外线、湿热等敏感。该菌是结核病的病原体，可侵犯全身各个器官，但以肺结核最为多见。其致病物质主要与其菌体成分如荚膜、脂质和蛋白质等有关，结核的免疫属于有菌免疫，结核菌素试验通过检测机体对结核菌素有无迟发型超敏反应，从而了解机体是否有过结核分枝杆菌感染，或对结核分枝杆菌是否具有免疫力,结核分枝杆菌的实验室检查主要包括临床标本涂片抗酸染色后直接显微镜检查和分离培养鉴定两大类，免疫学方法如结核菌素试验、抗原、抗体检测等也可辅助该菌的临床诊断，PCR技术可用于结核分枝杆菌DNA的快速检测非结核分枝杆菌主要包括不产色菌、暗产色菌和光产色菌三大类，前两者均包含快生长菌群和慢生长菌群，而后者均为慢生长菌群。这类抗酸菌作为条件致病菌常引起有潜在肺部疾病、免疫抑制或缺陷（如艾滋病）等患者的感染。麻风分枝杆菌形态和染色性与结核分枝杆菌类似，但不能进行人工培养，是典型细胞内寄生菌，主要引起慢性传染病麻风,
