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1、细菌的耐药性监测,实验中心,微生物检验在儿科临床的应用,抗菌药物抑制细菌生长，必须具备的条件：,细菌耐药性的概念,1：按遗传物质分类 固有耐药 获得性耐药 2：按耐药现象分类 交叉耐药 多重耐药,细菌耐药性的分类：,细菌耐药性的产生机制,分子遗传机制生化机制,细菌耐药的遗传性变异是基因结构发生改变。结构改变主要通过基因突变和基因的转移与重组。,分子遗传机制：,一、细菌的抗菌药物作用靶位的改变 二、细菌产生灭活酶（水解酶或修饰 酶） 三、药物累计不足,生化机制：,细菌产生诱导酶对抗生素的 作用靶位进行化学修饰,基因突变造成靶位变异使抗 菌药物不易或不能与靶位结合,一、抗菌药物作用靶位的改变,产生
2、耐药,细菌的生理功能正常,青霉素结合蛋白的改变 核糖体靶位酶亲和力的下降:导致细菌对氨基糖苷类、磺胺类、红霉素类、四环素类、氟喹诺酮类抗菌药物耐药。 型拓扑异构酶或DNA解旋酶的改变:导致金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肠杆菌科细菌和假单胞菌等对氟喹诺酮类抗生素耐药。 二氢叶酸代谢酶的改变：细菌改变二氢叶酸合成酶构型，可使该酶与磺胺类抗菌药物的亲和力大为降低，导致细菌对磺胺药耐药。 肠球菌对万古霉素的耐药机制：主要是其作用靶位，细胞壁五肽末端的D-丙氨酰- D-丙氨酸突变为D-丙氨酰-D乳酸或D-丙氨酸而导致耐药。,PBP： 是内酰胺类抗生素的作用靶位蛋白具有转肽酶或羧肽酶活性位于细胞膜上，参与
3、细胞壁合成在正常情况下：内酰胺类抗生素与PBP结合，可干扰细菌肽聚糖的正常合成。 在异常情况下：当某些细菌获得外源性DNA时，编码产生新的低亲和力的PBP或PBP本身发生修饰改变，对抗菌药物亲和力降低，从而导致该细菌对内酰胺类抗生素产生耐药。如：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌: （MRSA）产生一种新的低分子量的PBP2a，当有内酰胺类抗生素存在时，细菌表面5种正常的PBP被抑制，不能发挥正常生理功能，而PBP2a不被抑制，可作为转肽酶完成细胞壁的合成，使MRSA对所有内酰胺类抗生素产生耐药。,例如：青霉素结合蛋白（PBP)的改变,内酰胺酶氨基糖苷类钝化酶氯霉素乙酰转移酶红霉素酯化酶,二、细菌产生的
4、灭活酶（水解酶或修饰酶）,内酰胺酶: 细菌产生的以内酰胺类抗菌药物为水解产物的多种不同类型的降解酶，可使内酰胺键断裂造成内酰胺类药物失去活性。目前已知的内酰胺酶有200多种。 内酰胺酶类抗菌药物:包括青霉素与头孢菌素类等,为临床最常用的抗菌药物之一。这类药物的化学结构中均有内酰胺环,可抑制细菌细胞壁的合成,此环与他们的抗菌作用密切相关,当环被打开,则抗菌活性消失。,内酰胺酶的分类,超广谱内酰胺酶（ESBLs）主要由大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的广谱酶TEM-1、TEM-2和SHV-1突变形成。使细菌的耐药谱从青霉素和一、二代头孢菌素扩大到青霉素和一、二、三代头孢菌素及单环类，但对头霉素、碳青酶烯类及
5、酶抑制剂敏感。 AmpC酶为染色体介导的头孢菌素酶，几乎所有肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌都产生此酶。当此酶大量表达时，可导致细菌对除第四代头孢菌素、碳青酶烯类之外的所有内酰胺类抗生素耐药。且对内酰胺酶抑制剂及EDTA均不敏感。 金属内酰胺酶是一群能水解碳青酶烯类抗生素的酶，能被金属螯合剂螯合，不被酶抑制剂抑制。到目前为止至少发现了28种。,药物吸收减少,由于细胞壁的有效屏障或细胞膜通透性的改变，阻止药物吸收，使抗生素无法进入体内发挥作用,主动外排泵作用,在某些细菌外膜上存在特殊的能量依赖性的药物泵系统，能将进入菌体内的药物不断泵出，使菌体内的药物浓度不足以发挥抗菌作用而导致耐药,三、药物累计不足
6、,临床常见细菌对常见抗菌药物的主要耐药机制,药敏试验的目的,细菌耐药性监测,以临床细菌标本的药敏试验为基 础，分析所在医院或地区常见病原菌 耐药性的变迁。,2008年我院细菌耐药性监测,2008年7-9月G-杆菌耐药率,2008年抗生素使用排名,2008年1-6月G+球菌耐药率,2008年1-6月G-杆菌耐药率,2008年10-12月细菌耐药性监测,注： 超广谱内酰胺酶（ESBLs）检测19株G肠杆菌，14株阳性，阳性率为73.7。,培养出的细菌种类,特殊细菌的耐药菌株检测试验,1. 耐甲氧西林葡萄球菌检测(MRSA),由染色体mecA基因介导产生对苯唑青霉素等内酰胺类抗生素亲和力很低的青霉素
7、结合蛋白（PBP2a）。包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌（MRCNS）。 苯唑西林纸片法：MRSA13mm，MRCNS18mm MRSA阳性结果应注意：该菌对所有青霉素类、头孢菌素类、碳青酶烯类、氨基糖苷类、大环内酯类和含酶抑制剂的复合剂为耐药，不论检验报告的结果是否敏感。,2. 超广谱内酰胺酶检测（ESBLs）,ESBLs可与内酰胺环的羧基共价结合，使其酰胺键水解。 主要由大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的广谱酶TEM-1、TEM-2和SHV-1突变形成。使细菌的耐药谱从青霉素和一、二代头孢菌素扩大到青霉素和一、二、三代头孢菌素及单环类，但对头霉素、碳青酶烯类及酶
8、抑制剂敏感。 采用双纸片扩散法，即头孢他啶与头孢他啶/棒酸，头孢噻肟与头孢噻肟/棒酸组合，任何一组药物的抑菌直径之差5mm时判断ESBLs阳性。,3. AmpC酶的检测,AmpC酶为染色体介导的头孢菌素酶，优先作用底物是头孢菌素。 几乎所有肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌都产生此酶。当此酶大量表达时，可导致细菌对除第四代头孢菌素、碳青酶烯类之外的所有内酰胺类抗生素耐药。且对内酰胺酶抑制剂及EDTA均不敏感。 5种纸片初筛试验：头孢他啶、头孢他啶/棒酸、头孢西丁、亚胺培南和头孢吡肟，前三种耐药，后两种敏感。,4. 耐万古霉素肠球菌检测（VRE）：,耐万古霉素肠球菌（VRE）可分为VanA、VanB、V
9、anC三种类型。 由于MRSA增加，万古霉素使用大幅上升，导致临床VRE感染病人增加； VRE治疗比较困难，没有特定规律； 可供选择的有四环素、氯霉素、喹诺酮类，泌尿系可考虑呋喃妥因或磺胺类。,微生物检验在儿科临床的应用,沟 通理 解合 作,血培养标本的采集和运送,1. 血培养的数量 研究结果 一套血培养的阳性率为65 二套血培养的阳性率为80 三套血培养的阳性率为96 CLSI建议方针 对于每位需要血培养的患者需采取2至3套。 对于成年患者的血培养，只采单一的血培养是不允许的。因为单一血培养的结果的临床意义很难解释。 采血培养后的2至5天内，不需要重复采血培养，因为治疗后的2至5天内血液中的
10、感染细菌不会马上消失。,2. 血培养的采血量和时间 对于成年患者，每套血培养瓶推荐的采血量为0至0ml 对于婴幼儿患者，采血量不超过患者总血量的1（ 1kg采血2ml;1.1-2kg采血2ml；2.1-12.7kg采血4ml;，12.8-36.3kg采血10ml） 采血尽量在寒战或发热后及未使用抗生素之前完成。在评估可疑新生儿败血症时，除发热或低烧外，很少培养出细菌的，应该补充尿液和脑脊液培养。,3. 标本的运送血培养瓶在采血接种后必须马上送检 血培养瓶在采血接种后在室温中不得超过数小时 血培养瓶不得在采血接种后放入冰箱或冷冻,4. 培养时间与阳性率 BACTEC 9240 需氧瓶中5天的培养
11、结果孵育5天后共检出1133株有临床意义的菌株907株(80.0%) 在24小时内检出162株(14.3%) 在24-48 小时检出18株在96小时以后检出在第5天检出的细菌S. aureus 4 E. faecalis 1Klebsiella spp. 5 Serratia spp. 1Brucella spp. 2 Candida spp. 3C. neoformans 1,痰标本的采集和运送,小儿取痰方法用压舌板向后压舌，用棉拭子伸入咽部，小儿经压舌刺激咳嗽时，可喷出肺部或气管分泌物粘在拭子上，取后立即送检。,痰标本的检验与临床,痰中可分离到的三大类呼吸道感染的病原菌结核杆菌、白喉棒状杆
12、菌、百日咳杆菌公认的病原菌 肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡它布拉汉菌逐渐被认识的CAP病原菌 肠杆菌科细菌、非发酵菌、葡萄球菌等条件致病菌,痰中检出结核杆菌,白喉棒状杆菌, 百日咳杆菌属于确诊报告 痰中培养出肺炎链球菌,流感嗜血杆菌,卡他布拉汉氏菌基本上可以确诊为社区获得性肺炎的病原菌. 除此以外的其他革兰阴性杆菌,革兰阳性球菌,真菌属参考报告.参考的价值约30%.,目前，痰中分离出的细菌种类大致排位是：绿脓杆菌，不动杆菌，肺炎克雷伯菌，阴沟肠杆菌，变形杆菌，大肠杆菌，某些少见的肠杆菌科细菌及非发酵菌，葡萄球菌，念珠菌，粪肠球菌,肺炎链球菌,流感嗜血杆菌.几乎全部是条件致病菌,条件致病菌的几种身
13、份 病原菌：患者由这类菌引起感染，用细菌报告提示的抗生素治疗，疗效明显 定植菌：用细菌报告提示的抗生素治疗，该菌消失，感染症状依然存在或是由于该菌泛耐药，临床凭经验联合用药，感染症状好转，但该菌依然存在上述两种现象说明，细菌报告中的病原菌与感染毫无关系 污染菌：留取标本过程中，污染了非感染部位的细菌,某种情况：,患者的感染已基本治愈，做痰检的目的是希望得到一张阴性报告做为停止治疗,出院的凭证。 培养：生长大量阴性杆菌，较常见的是绿脓杆菌和不动杆菌 患者已接受了较长时间的抗生素治疗，在清除了病原菌的同时，上呼吸道的正常菌同时被杀伤，定植抗力削弱，医院中常见的绿脓杆菌，不动杆菌由于耐药性极强，有机
14、会在上呼吸道大量生长。 这类细菌致病力较弱，与宿主形成和平共处的状态，这是典型的定植现象。 清除这些不应在呼吸道大量生长的定植菌最佳的手段是停用抗生素，让呼吸道正常菌群重新生长，拮抗定植菌。,粪便标本的采集和运送,自然排便法：自然排便后，挑取有脓血、黏液部位的粪便23克，液状粪便取絮状物盛于无菌的容器内送检。 直肠拭子方法：如不易获得粪便时或排便困难的患者及幼儿，可采取直肠拭子方法采集，取出后插入灭菌试管内送检。以肥皂，水和70的酒精，将肛门周围洗净，然后用一根浸过无菌生理盐水的棉拭子，插入肛门约mm处，轻轻旋转，使之与直肠黏膜表面接触，然后取出置于无菌试管中立刻送至微生物室,粪便标本的检验和
15、临床,粪便检验主要是患者出现腹泻症状，而引起腹泻的原因主要有：1.细菌感染2.食物中毒3.菌群失调 患者吃了不清洁的食物，出现腹泻、呕吐、发热等症状前来就医 医生根据患者主述，大便常规检验,诊断为菌痢或肠炎 治疗：静脉补液加抗生素 这种有效的治疗方法至今还在延用,但下述情况，此方法无效：,住院长期使用抗生素的患者，出现腹泻症状（每日次数增多，大便呈糊状），腹部不适，食欲欠佳。其本质原因是治疗其他感染性疾病所使用的抗生素在发挥治疗作用的同时伤及肠道正常菌群，数量上占优的原籍菌被杀灭或抑制，而某些耐药的少数菌乘机大量繁殖，引起肠道生态失调。,肠道生理菌群的主要种类及分布 紧贴肠黏膜：以双岐杆菌、乳
16、酸杆菌为主 中间层：类杆菌、真杆菌、消化球菌和消化链球菌等 外层：大肠杆菌、粪肠球菌为主 共400余种细菌按一定数量比例、空间层次构成一个相对稳定的和谐微生态社会 具有较强的缓冲能力，维持人体生态平衡,抗生素相关腹泻 抗生素治疗的结果：杀敌一千，自损八百 近期损伤：严重的菌群失调，生态平衡打破，超过肠道缓冲能力，肠蠕动加快，大便糊状或稀便，腹部不适，食欲减退 远期损伤：经抗生素杀菌后存活下来的细菌，为高度耐药菌群,如产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌、MRSA、VRE，这些条件致病菌如若定位转移，造成其他器官或系统的感染，治疗将极为困难,抗生素相关性腹泻的实验室诊断抗生素相关性腹泻的本质是肠道菌群失调细菌培养的现象：1.未生长志贺氏菌、沙门氏菌2.未生长真菌3.未生长或生长少量大肠杆菌4.生长其它阴性杆菌或阳性球菌这种现象就是肠道菌群失调,
