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1、1,第五章 细胞融合与单克隆抗体,2,本章主要内容： 细胞融合的基本概念 人工诱导细胞融合技术 杂种细胞的筛选 细胞杂交瘤技术与单克隆抗体 人源单克隆抗体,3,细胞融合（cell fusion)，是指在离体条件下将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。 细胞融合技术的出现标志着细胞工程的诞生！,一、细胞融合的定义,4,5,自发细胞融合,（一）细胞膜融合 受精过程 （二）体内细胞的自发融合 1、肌管的形成 2、胚胎着床 3、巨细胞和破骨细胞的形成 4、肿瘤细胞的融合,6,显微镜下细胞融合过程,7,二、人工诱导细胞融合,诱导细胞融合的主要方法有： 病毒诱导融合
2、化学融合剂诱导融合 物理方法（电融合）,8,二、人工诱导细胞融合,（一）病毒诱导的细胞融合 有许多种类的病毒能介导细胞融合，如疱疹病毒、副粘液病毒、鸡新城疫病毒等。其中最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ）,为RNA病毒。,9,灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面,细胞膜被病毒颗粒穿通,细胞膜连接,细胞融合，形成杂种细胞 （细胞膜具有一定的流动性）,生物法：,灭活的病毒,（丧失感染性、保留抗原结构）,10,病毒促使细胞融合的主要步骤：,两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近； 通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透； 两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体； 进入
3、正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。,11,化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物（如甘油-醋酸酯、油酸、油胺等）、脂质体（如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸等）、钙离子、水溶性高分子化合物（如聚乙二醇）、水溶性蛋白质和多肽（如牛血清白蛋白、多聚L-赖氨酸等）， 其中最常用的是聚乙二醇（PEG）。 1、聚乙二醇(PEG)法 2、 Ca2+法 3、溶血卵磷脂 优点是易得，用法简单，融合效果稳定。,(二) 化学方法诱导细胞融合,12,PEG的作用机理： 由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连
4、进而促使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。,PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。,13,聚乙二醇（PEG）法细胞融合步骤 （1）将两种不同亲本细胞各5l06混匀； （2）离心沉淀，吸去上清液； （3）加1ml 50PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟； （4）加9ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液； （5）加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养 液至 5ml，37的CO2培养箱中培养。 （6）624小时
5、后，换成选择培养液筛选杂交细胞。,14,（三）物理方法诱导细胞融合,电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。 电融合法的优点： 融合率高、重复性强、对细胞伤害小； 装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程； 免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。,15,电融合的基本过程： 细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排
6、列成串； 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。,电融合诱导法原理示意图,16,三、杂种细胞的筛选,根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型，可将其分为以下几种类型： 异核细胞：非同源细胞的融合体。 同核细胞：两个相同细胞的融合体。 多核细胞：含有双亲不同比例核物质的融合体。,17,基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选 基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选 由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选 具有所需性状杂种细胞的筛选,常用的杂种细胞筛选方法,18,细胞融合的意义,理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物
7、资源。这 对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。 融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间 的遗传物质交换提供了有效途径。 体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分 裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新 的核外遗传系统。 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。,19,四、细胞杂交瘤技术与单克隆抗体,20,21,免疫器官：免疫细胞生成、成熟或集中分布的场所，包括骨髓、胸腺、脾、淋巴结等 免疫细胞（发挥免疫作用的细胞）： 1吞噬细胞 2淋巴细胞（起源骨髓中的造血干细胞） T细胞（在胸腺中成熟） B细胞（在骨髓中成熟） 免疫活性物
8、质：由免疫细胞或其他细胞产生的发挥免疫作用的物质，包括抗体、淋巴因子、溶菌酶等,22,23,基本概念,抗原 抗体 抗原决定簇（抗原表位） 细胞克隆 多克隆抗体 单克隆抗体,24,抗原（antigen，Ag），是指一种能刺激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的物质。 抗原的基本性质具有异物性、大分子性和特异性。 异物性是指进入机体组织内的抗原物质，必须与该机体组织细胞的成分不相同。 大分子性是指构成抗原的物质通常是相对分子质量大于10000的大分子物质，分子量越大，抗原性越强。 特异性是指一种抗原只能与相应的抗体或效应T细胞发生特异性结合。,25,抗体（
9、antibody,Ab)是机体免疫系统在抗原刺激下，由B细胞或记忆细胞增殖分裂成浆细胞所产生的可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。 主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能。,26,抗原决定簇（Antigenic determinant）,是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称表位(epitope). 抗原以抗原决定簇与相应淋巴细胞的抗原受体结合而激活淋巴细胞引起免疫应答。 淋巴细胞表面的抗原识别受体通过识别抗原决定簇而区分“自身”与“异己”。 抗原也是以抗原决定簇与相应抗体特异性结合而发生反应的。,27,细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团,28,29,
10、多克隆抗体（Polyclonal antibody,PcAb）： 针对多种抗原决定簇的混合抗体,30,克隆选择学说：淋巴细胞在与抗原接触前就已经存在多种多样的与抗原专一性结合的受体，一种细胞带一种受体，进入机体的抗原选择性的结合其中的个别淋巴细胞，使之活化，增殖产生大量带有同样受体的细胞群，分泌同样的抗体。当抗原进入体内，在机体中就会诱导出针对不同抗原决定簇的多种抗体，如果要把这些抗体一一分开，用现有的生物化学或物理化学方法是根本办不到的。,31,32,1975年科勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein)将小鼠免疫细胞与肿瘤细胞融合，培养出既能迅速生长无限繁殖又可分泌特异性抗体的杂交瘤
11、细胞。从而获得针对某一特殊抗原决定簇的单克隆抗体。,33,一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖,杂种细胞,动物细胞培养技术,设计方案：,动物细胞融合,创始人：米尔斯坦,单克隆抗体,既能产生特异性抗体，又能大量繁殖,34,单克隆抗体（Monoclonal antibody,McAb） 由单个B细胞克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源抗体,35,36,单克隆和多克隆抗体的比较和用途,特异性,敏感性,均一性,McAb,PcAb,低,差,无,高,强,有,1、用于免疫学检测，辅助临床诊断,2、McAb用于亲和层析，分离微量可溶性抗原,3、标记的McAb用于基础研究，了解细胞分
12、化等,4、制备生物导弹用于肿瘤、移植等的临床治疗。,37,单克隆抗体在医学中的应用,检验医学诊断试剂 （1）病原微生物抗原抗体的检测 （2）肿瘤抗原的检测 （3）免疫细胞及其亚群的检测 （4）激素测定 （5）细胞因子的测定 蛋白质的提纯 肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术,动物细胞融合技术,B 、BB 、B瘤 、瘤瘤 、瘤,只有杂种细胞才能活,动物细胞培养,单克隆抗体制备过程,获得产生相应抗体的B淋巴细胞,39,动物细胞融合技术,B 、BB 、B瘤 、瘤瘤 、瘤,只有目的杂种细胞才能活,单克隆抗体制备过程,40,HAT选择培养基,HAT选择培养基组分 次黄嘌呤核苷酸（hypoxanthine,H
13、) 氨甲喋呤（aminopterin,A)（二氢叶酸还原酶抑制剂） 胸腺嘧啶核苷酸（thymidine,T),41,细胞DNA合成途径,1.主要途径： 氨 基 酸 谷 氨 酰 胺 尿核苷单磷酸 叶酸及其衍生物（必不可少的媒介） 2.补救途径：次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 （HGPRT） 胸腺嘧啶核苷酸激酶（ TK）,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,视频：单克隆抗体的制备,52,53,55,ELISA原理,使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性 结合在固相载体
14、上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关,57,ELISA基本的实验过程,包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化 抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定 酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色,69,70,单抗纯化方法：,盐析 凝胶过滤 离子交换层析 亲和层析法,71,用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀
15、析出。 血清 50%饱和度硫酸胺 上清 （清蛋白） 沉淀（球蛋白） 33%饱和度硫酸胺 上清 沉淀 拟球蛋白 r球蛋白,盐 析 法,72,凝胶过滤法,干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒，将蛋白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时，大分子蛋白不能穿过凝胶网孔进入胶粒内，留在胶粒间隙的溶液中，随洗脱液最先流出，小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内，受到凝胶的阻留，向下移动较慢洗脱出来较慢，据此将不同大小的蛋白质分离出来。 交联葡聚糖凝胶(Sephadex) 琼脂糖凝胶(Sepharose),73,离子交换层析法,DEAE纤维素：结合溶液中带负电荷的蛋白质，又称阴离子交换剂 CM纤维素：结合溶液中带正电荷的蛋
16、白质，又称阳离子交换剂,74,亲和层析法,将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸附液相中的抗体（或抗原），形成抗原抗体复合物，然后改变条件，使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化的抗体（或抗原）,75,单克隆抗体特性 理化性状高度均一，生物活性专一，只与一种抗原表位发生反应，特异性强，纯度高，易于实验标准化和大量制备,76,单抗鉴定方法：,效价 （凝集反应、Elisa、放免） 特异性（免疫荧光、 Elisa 、间接血凝、免疫印迹）,77,原理：Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。,
