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1、第六章 固定化酶与固定化细胞,固定化酶定义的形成以及扩展,固定化酶是20世纪50年代发展起来的一项新技术，最初称“ 水不溶性酶 ”（water insoluble enzyme）和 “ 固相酶 ” （solid phase enzyme),是将水溶性的酶与不溶性的载体结合起来。后来，人们发现可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤膜的一边，反应产物可以透过膜逸出。这种情况下，酶本身仍处于溶解状态，只不过是被固定在一个有效的空间内。再用上面的名字已不合适。 1971年第一次国际酶工程会议上统一称为“ 固定化酶”。（immobilized enzyme ）是指在一定空间内成闭索状
2、态存在的酶，能连续地进行反应，反应后酶可以回收利用。“ 固定化的生物催化剂” 包含酶、含酶细胞及微生物的固定化。1,生物催化剂固定化的优点,某些酶回到了它在体内的原始状态。 可以重复使用，节约了成本。 使用时方便得多，对产物抑制型反应既有利又方便。 催化剂易和产物分离，有利于提高产品质量（如生产针剂药品，最后不能含蛋白质）。 大多数情况下催化剂固定化后稳定性提高。 酶反应过程可以控制。 较游离酶更适合于多酶体系反应。,固 定 化 的 缺 点,1、固定化过程需成本（人力物力）。 2、固定化酶活力回收率往往不高。 3、载体对于底物和产物的扩散存在空间障碍（尤其是大分子）。 结论：不是所有的情况下都
3、需固定化！,固定化时应遵循的原则,尽量减少酶的活力损失和专一性的改变（即尽量减少酶活性部位的变化和酶高级结构构象的破坏）。 要有一定的机械强度（保证使用顺利）。 尽量减少空间位阻。 尽可能和载体结合牢固。 所用方法有利于酶稳定性提高。 制备成本要低。,酶的固定化的方法,物 理 吸 附 法2,载体：无机物多孔，机械强度高；有机物天然和合成高分子。 结合力：范德华引力，疏水作用力等。 优点：酶活力损失小（构象基本不变），方法简单。 缺点：固定化酶半衰期短（易脱落）。 固定对象：酶和细胞都行。,离 子 结 合 法3,载体：阴、阳离子交换剂（树脂或凝胶） 结合力：正负离子静电吸引力。 优点：结合较物理
4、吸附牢固；酶活力损失小；半衰期较物理吸附长；载体能回收。 缺点：固定化酶牢固程度易受PH影响；高离子强度可使酶和载体的结合力降低。 固定对象：一般用于酶的固定化（细胞分子量太大）。,化学结合法-共价结合法4,载体（必须具有反应基团）：无机物；天然有机物（尤其是多糖类），合成聚合物。 结合力：共价键。 优点：酶和载体结合最牢固；半衰期长。 缺点：酶活力回收率低；成本较高；载体不能回收。 固定化对象：酶。细胞一般不用此法。 操作提示：载体的基团如反应性不强（如多糖的羟基），可先活化后与酶反应。反应时注意保护酶的活性中心，必要时可用底物或效应物于反应前饱和。,化学结合法交联法,载体：就是交联剂。交联
5、剂多是含双功能或多功能基团的试剂。交联剂和酶相互交织在一起。 结合力：共价键。 优点：同上。另固定化操作比上法容易。 缺点：同上。 对象：酶、细胞、微生物。酶电极所用酶膜常用此法制备。 操作要点：交联剂浓度不宜太大。操作时要保护酶活性中心。,包 埋 法5,包埋法适用面广，只要生物催化剂体积足够大，或包埋介质的孔隙足够小，酶不易渗漏即可，以保证一定的半衰期。 采用网格法和微囊法将酶或细胞包埋在一定的小空间里。此法催化剂和载体一般不发生反应，所以包埋法酶活力回收率较高。 包埋介质孔隙小了会对大分子底物和产物的流动产生传质障碍。例如聚丙烯酰胺包埋细胞时浓度不宜太高。,网 格 法,载体： 1、天然高分
6、子（如海藻胶）先融化，再冷却，但在凝聚前和催化剂混合，再冷却就成了凝胶。切割后就成了固定化催化剂。若在搅动情况下滴到高浓度钙离子中，颗粒强度会增加。 2、合成高分子（如聚丙烯酰胺）：单体在聚合前和催化剂混合，聚合后催化剂就被包埋在网格里面了。,微 囊 法6,通过各种膜，将催化剂包埋在直径为几微米的微囊中。 多种方法（如界面沉淀法、界面聚合法、二级乳化法等）可供选择。其中脂质体包埋法就是将卵磷脂和催化剂混合后用超声波打碎即可。 下面介绍两种新型固定化方法。,结 晶 法,任何溶液要达到结晶水平必须具备两个条件：一是纯；二是浓（过饱和）。缺一不可。 结晶靠的是非共价力：离子健、氢键、范德华引力 晶体
7、比无定型的聚集体刚性强。 晶体既是载体又是催化剂本身。 先结晶，后交联，可使结晶更牢固。,分 散 法,酶溶液脱水得干粉分散于非极性有机溶剂中，可看成为分散的固定化酶。 此体系适合于产物不溶于水的反应，如酸加醇生成酯。 酶越分散（最好是单分子），催化效率越高。 将酶和亲酯化合物（如聚乙二醇）连接，可增加酶在有机溶剂中的溶解度（分散度）。 将酶用多孔载体吸附，也可增加分散度。,固定化酶的性质（和溶液酶比较） 7,活力：一般降低。 稳定性（热、pH、蛋白酶、抑制剂、）：一般升高。 最适温度：一般提高。 最适pH：载体带负电时碱移。 米氏常数Km ：载体不带电 Km一般升高；载体和底物电荷相反 Km降
8、低,细 胞 的 固 定 化8,可固定的细胞类型：微生物、植物、动物 细胞的生理状态分为： 1、死细胞（完整细胞、细胞碎片、细胞器） 2、活细胞（增殖细胞、静止细胞、饥饿细胞）,固定化细胞的优点,1、固定化细胞的密度大、可增值，可以获得高度密集工程菌的集合体，不需要微生物菌体的多次培养、扩大，从而缩短了发酵生产周期，提高了生产能力。 2、发酵稳定性好，可以较长时间反复使用或连续使用，未来可以将发酵罐变成为反应柱进行生产。 3、发酵液中含菌体少，利于产品的分离纯化,固定化细胞的缺点,利用的仅仅是胞内酶，细胞内多种酶的存在，会形成一些不需要的副产物 细胞膜、细胞壁和载体都存在扩散限制作用 载体形成的
9、孔隙大小影响高分子底物的通透性,固定化细胞的制备,制备方法与固定化酶基本相同 微生物菌体本身是天然的固定化酶，经过适当的条件，例如可经过热处理使其它酶失活，而保存所需酶的活力，再固定化。 固定化完整细胞的方法有多种，但还没有一种理想的通用的方法，固定化细胞的制备的总原则就是找到价格低廉、简便的方法，酶活力保留值要高，操作要稳定。,辅酶的固定化 为什么要固定化辅酶？,许多酶（约1/3）需要辅酶才能起催化作用； 辅酶分子一般较小，即使在超滤膜中也易渗漏，因此必须采用特殊方法固定。,辅酶固定化的要点,辅酶和载体间加间隔臂（手臂），目的是可以避开大分子载体的空间障碍，能和脱辅基的酶蛋白（apoenzy
10、me）自由配合。 和可溶性大分子（如PEG）结合后（即高分子化）可以被限制在超滤膜中和apoenzyme自由配合。,评价固定化酶（细胞）的指标,固定化酶的活力是指固定化酶（细胞）催化某一特定反映的能力。可用在一定条件下它所催化的某一反映的反应初速度来表示。单位为每毫克干重固定化酶（细胞）每分钟转化底物的量umol.min-1.mg-1 因固定化酶（细胞）通常是颗粒状，所以其活力测定要适当改进，以测定过程分类，可分为间歇测定和连续测定,间歇测定和连续测定,间歇测定（震荡测定）：在搅拌或震荡的反应器中，再与溶液酶同样的条件下（均匀悬浮于保温的介质中），然后间隔一定时间取样，过滤后按常规测定底物的消
11、耗量或产物的生成量就可以。 连续测定（柱法测定）：将固定化酶装入具有恒温水夹套的柱中，以不同的流速使底物流过酶柱，收集流出的的反应物。按常规测定底物的消耗量或产物的生成量就可以。,偶联率及相对酶活力的测定,偶联率=（加入酶的活力-上清液酶的活力）/加入酶的活力x100% 相对酶活力=固定化酶的总活力/加入酶的总活力x100% 活力回收=固定化酶的总活力/加入酶的总活力x100% 偶联率=1时，表明固定化的程度好，固定化引起的酶的失活不明显。,固定化酶半衰期（T1/2）的测定,测定半衰期的意义：评价固定化方法；生产上决定更换酶的时机。 定义：从开始到活力只剩一半时所经历的时间。有使用半衰期，贮藏
12、半衰期等。 方法：直接法测既费时、费力，有时还不可行（如半衰期很长）。 参考测定放射性元素半衰期的做法，间接测定。,间接法测定固定化酶半衰期T1/2,1、先测定并计算固定化酶活力衰减常数Kd ： 测定固定化酶初始酶活E0, 和过了时间t后的酶活E 。则衰减常数Kd 为： Kd（2.303/t）x Lg（E0/E）2、再计算半衰期：T1/2 0.693/ Kd,固定化催化剂的特殊应用（一） 用 于 基 础 研 究,固定化催化剂最大量、最普遍的应用是作为工业生物催化剂使用的，这在酶的应用一章已经讲过。此处只介绍除此以外的“ 特殊”应用。 酶结构和功能的研究。 生物活性蛋白的定向固定作为揭示蛋白内部
13、反应和功能的工具。,固定化催化剂的特殊应用（二） 亲和分离系统,生物亲和力：一种综合的力（一般不含有共价键），是生物活性分子之间特有的一种高亲和、高专一性的作用。这种作用可逆。是生物长期进化的结果。 亲和分离（亲和层析）：利用某些生物分子（如抗原和抗体）之间的亲和力进行高效分离。 做法：将互为配体（ligand）和配基（ligate）中的任何一个固定在固相载体上，用于从混合物中迅速识别、吸附、浓缩另一个。效率很高。,固定化催化剂的特殊应用（三） 药 物 控 释 载 体 9,药物释放要求： 定点（靶向性）； 定量（太高太低均有害）； 避免被（胃酸、蛋白酶）破坏； 避免引起免疫反应。 措施：聚合物修饰；凝胶包埋；制成微球制剂或脂质体、具有导向性的药物等。,固定化催化剂的特殊应用（四） 生物传感器,特点：敏感（感应）元件由生物材料做成。 酶电极：酶膜电化学传感器（氧电极、PH电极、阳离子电极等）。 酶膜：用交联或其它方法固定的酶。 生物芯片：固定化的生物活性物质（如蛋白质芯片）。 应用：和传统生化分析相比，本法检测速度快，样品量少，生物活性物质可反复使用。,
