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1、429572439gao,课题3,酵母细胞的固定化,429572439gao,课题背景,酶制剂的优点： 催化效率高、低耗能、低污染，大规模地应用于食品、化工等各个领域。,429572439gao,酶制剂存在的缺陷： 1、通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活；2、溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；3、反应后会混在产物中，可能影响产品质量。,429572439gao,如果你是工程技术人员，你如何解决这个问题？,固定化酶技术,即将酶固定在一定空间内的技术（如固定在不溶于水的载体上）。,429572439gao,基础知识,（一） 固定化酶的应用实例 生产高果糖浆,
2、1、高果糖浆的生产原理：,高果糖浆是果糖含量为42%左右的糖浆。作为蔗糖的替代品，高果糖浆不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿病、龋齿和心血管病，对人的健康更有益。,葡萄糖异构酶的优点:,稳定性好、可以持续发挥作用,429572439gao,.2、固定化酶的反应柱示意图,使用固定化酶技术，将葡萄糖异构酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这种酶颗粒装在一个反应柱内，柱子底端装有分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由出入。,429572439gao,3、高果糖浆的生产操作：从反应柱上端注入葡萄糖溶液，从下端流出果糖溶液，一个反应柱可连续使用半年。,4、固定化酶技术的优点：,酶既
3、能与反应物接触，又容易与产物分离，提高产品质量；同时固定在载体上的酶还可以反复利用，节约成本。,429572439gao,1、概念：固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。,（二）固定化细胞技术,2、常用方法：包括包埋法、化学结合法和物理吸附法。,429572439gao,3、酶和细胞固定方法的选择,酶适合采用化学结合和物理吸附法固定,细胞适合采用包埋法固定，即将微生物细胞均匀的包埋在不溶于水的多孔性载体上,固定化细胞常用的载体,明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺等,429572439gao,酶的几种固定方式,将酶包埋在细微网格里,将酶相互连接起来
4、,将酶吸附在载体表面上,包埋法,化学结合法,物理吸附法,429572439gao,课堂讨论：,1从操作角度来考虑，你认为固定化酶技术与固定化细胞技术哪一种方法更容易？哪一种方法对酶活性的影响更小？2固定化细胞固定的是一种酶还是一系列酶？3如果想将微生物的发酵过程变成连续的酶反应，应该选择哪种方法？4如果反应物是大分子物质，又应该选择哪种方法？,固定化细胞技术,固定化细胞固定的是一系列酶,固定化细胞技术,固定化酶技术,429572439gao,思考将谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸的发酵过程变为连续的酶反应，应当固定（酶、细胞）；若将蛋白质变成氨基酸，应当固定（酶、细胞）。,429572439gao,思
5、考将谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸的发酵过程变为连续的酶反应，应当固定（酶、细胞）；若将蛋白质变成氨基酸，应当固定（酶、细胞）。,429572439gao,直接使用酶、固定化酶和固定化细胞催化的优缺点,429572439gao,实验设计,（一）制备固定化酵母细胞,1酵母细胞的活化 2配制物质的量浓度为0.05 molL的CaCl2溶液 3配制海藻酸钠溶液 4海藻酸钠溶液与酵母细胞混合 5固定化酵母细胞,（二）用固定化酵母细胞发酵,429572439gao,1、酵母细胞的活化,问：什么是活化？怎样活化？应注意什么？,（一）制备固定化酵母细胞,取1g干酵母，放入50 ml的小烧杯中，加入蒸馏水10 ml
6、，用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀，成糊状，放置1h左右使其活化。,活化：就是让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态,注意事项 A、选用的干酵母要具有较强的活性，而且物种单一 B、在缺水状态下，微生物处于休眠状态。注意水的用量 C、酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积足够大的容器,429572439gao,2、配制物质的量浓度为0.05mol/L的C aCl2溶液,称取无水CaCl2 0.83g。放人200mL的烧杯中，加入150mL的蒸馏水，使其充分溶解，待用。,注意事项 溶解物质要彻底，勿用自来水溶解，以防自来水中各种离子影响实验结果,429572439gao,3、配制海
7、藻酸钠溶液,称取0.7g海藻酸钠，放入50ml小烧杯中，加入10ml水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，用蒸馏水定容至10ml,注意事项,加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止,429572439gao,海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，影响实验效果。,429572439gao,4、海藻酸钠溶液与酵母细胞混合,将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加人已活化的酵母细胞，进行充分搅拌，使其混台均匀，再转移至注射器中,注意事项 A、溶化好的海藻酸钠溶液必须
8、冷却至室温，否则会因温度过高杀死酵母菌 B、搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察,429572439gao,5、固定化酵母细胞,以恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，将形成的凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右,注意事项,A、可利用海藻酸钠制成不含酵母菌的凝胶珠，用作对照,B、海藻酸钠胶体在CaCl2这种电解质的作用下，发生聚沉，形成凝胶珠，需稳定30min左右,429572439gao,429572439gao,（二）用固定化酵母细胞发酵,将固定化酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗23次，洗去凝胶珠表面多余的电解质溶液,将150ml质量分数为1
9、0的葡萄糖溶液转移至200ml的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于25C下发酵24h,429572439gao,刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法：一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。 二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的,429572439gao,注意事项,控制好发酵温度，一般是室温25 C,发酵时间可视具体情况而定，一般时间稍长一些，效果明显,可用不含酵母的凝胶珠做相同的处理，对照实验结果,4295
10、72439gao,海藻酸钠在水中溶解的速度较慢，需要通过加热促进其溶解。溶解海藻酸钠，最好采用小火间断加热的方法。例如，加热几分钟后，从石棉网上取下烧杯冷却片刻，并不断搅拌，再将烧杯放回石棉网继续加热，如此重复数次，直至海藻酸钠完全溶化。如果加热太快，海藻酸钠会发生焦糊。,三、操作提示,429572439gao,（一）观察凝胶珠的颜色和形状 如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。 （二）观察发酵的葡萄糖溶液 利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时
11、会闻到酒味,四、课题成果评价,429572439gao,1、下列有关固定化技术的叙述，正确的是（ ） A固定化酶只是在细胞内才能发挥作用 B固定化酶能提高酶的利用率 C酶的固定是酶分离纯化的常用方法 D固定化酶的固定化方式就是吸附在固体表面上。,B,2、关于固定化细胞的叙述，正确的是（ ） A催化效率高，低耗能、低污染 B对环境的条件非常敏感，容易失活 C既能与反应物充分接触，又能与产物分离 D成本低、操作简单，但反应效果可能很低,C,课堂练习,429572439gao,3、关于酵母菌的叙述，正确的是（ ) A酵母菌在营养物质充足时、环境适宜时，依靠有性生殖进行繁殖 B酵母菌的代谢类型时异养厌
12、氧型 C酵母菌的生物膜系统包括细胞膜、核膜、各种的细胞器膜等膜 D用酵母菌酿酒时，应先密封后通气,C,课堂练习,429572439gao,4、某一实验小组的同学，欲通过制备固定化酵母细胞进行葡萄糖溶液发酵实验，实验材料及用具齐全。 (1)酵母细胞的固定采用的方法是_。 (2)请完善该实验小组的同学在制备固定化酵母细胞过程的步骤： 配制氯化钙溶液时应用蒸馏水。 海藻酸钠溶液应用_加热。 海藻酸钠溶液必须_才能加入酵母细胞。 注射器中的海藻酸钠和酵母细胞的混合物应滴入_ 中形成_。,包埋法,小火或间断,冷却至室温,氯化钙溶液,凝胶珠,429572439gao,(3)该实验小组用如图所示的装置来进行
13、葡萄糖发酵。 为使该实验中所用到的固定化酵母细胞可以反复运用，实验过程中，一定要在_条件下进行。 加入反应液后的操作是关闭_。 装置的长导管起到什么作用？_。实验过程中，可能会出现的现象：_,无菌,活塞1和活塞2,释放CO2 ，减小反应柱内压力并可防止其他微生物污染,有气泡产生、有酒味散发,429572439gao,【解析】 由于细胞过大，难以被吸附或结合，因此多采用包埋法进行固定化。操作过程中，必须等海藻酸钠溶液冷却后才能将其与酵母细胞混合，否则酵母细胞会在高温下死亡。酵母菌利用葡萄糖的发酵过程中会产生CO2，为减小装置中的压力，应及时将其排出。 【答案】 (1)包埋法 (2)小火或间断 冷却至室温 氯化钠溶液 凝胶珠 (3)无菌 活塞1和活塞2 释放CO2 ，减小反应柱内压力并可防止其他微生物污染,429572439gao,直接使用酶、固定化酶和固定化细胞催化的优缺点 P52,
