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1、基因表达谱研究技术发展及其在农业科学中的应用,目录,1,mRNA差异显示技术,2,抑制消减杂交技术,3,cDNA-AFLP技术,4,基因表达系列分析技术,5,微阵列技术,一、mRNA差异显示技术的概述,二. DDRT-PCR的发明及其基础,由Liang于1992年创立 是分离差异表达基因强有力的工具 在随后几年里， Liang等在技术方面做了大量改进，使技术更适用、更简便 基于RT-PCR理论，依赖于3种技术 1）RT-PCR技术 2）以特定引物进行的PCR技术 3）DNA电泳技术,三、mRNA差异显示技术的原理：,mRNA差异显示技术的主要原理是利用cDNA反转录技术,PCR扩增和高分辨率聚
2、丙烯酰胺凝胶电泳技术，来显示PCR产物的差异。,四.DDRT-PCR目前的应用领域,基因表达差异 基因的鉴定与克隆 抗逆性机理的研究 探究激素调控机理,五. DDRT-PCR一般操作步骤,总RNA的提取与反转录 RT-PCR 聚丙烯酰胺凝胶电泳及差异DNA条带的回收 PCR在扩增及其产物的回收 测序和数据库比对分析 实时定量PCR,mRNA差异显示技术简略流程图,六. DDRT-PCR的优点,以RT-PCR和DNA凝胶电泳为基础 灵敏度高，仅需0.2g的总RNA 可以同时比较多个样品间基因表达的差异 可以同时检测到“上调”及“下调”的基因 时间短，实验过程中可步步验证比较 可进行多基因家族的表
3、达分析,七.DDRT-PCR的缺点,假阳性高 绝大多数差异条带仅含有3-UTR 500bp以内的一短片段的信息，这些区域的序列结构相对保守，得不到特异的基因 对低丰度mRNA检出率低,一、抑制消减杂交技术的概述,二. SSH的发明及其基础,由Diatchenko于1996年创立 是鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术 基于RT-PCR理论，依赖于3种技术 1）RT-PCR技术 2）以特定引物进行的PCR技术 3）酶切技术,三、抑制消减杂交技术的原理：,抑制消减杂交技术原理是以抑制性多聚酶链反应（PCR）反应为基础的cDNA消减杂交技术。通过合成两个不同的接头,连接于测试cDNA片段的5末端
4、,达到选择性扩增差异性表达的cDNA片段,抑制非目的cDNA的扩增的目的。,四.SSH目前的应用领域,主要用于疾病研究及动物发育中的应用 植物基因的分离 微生物技术的应用,五. SSH一般操作步骤,由RNA合成 cDNA Rsa I 限制性内切酶酶切 cDNA 末端接头连接 第一、二次消减杂交 末端补齐 第一、二次PCR扩增 富集差异表达基因,六. SSH的优点,该方法的最大优点是降低了假阳性率 SSH方法具有高度敏感性 降低了起始样品的使用量 具有较高的检测效率和克隆效率 具有背景低、重复性强等优点 程序相对简单，操作简便易行,七.SSH的缺点,SSH技术需要较多的起始材料且更多地依赖于PC
5、R技术 消减库中的cDNA经过Rsal等限制酶消化后，不再是全长cDNA 不能同时对数个材料之间进行比较,材料之间存在过多的差异及小片段缺失也不能有效被检测 完全无酶切位点的片段或酶切位点较少的基因组无法用SSH技术筛选,一、cDNA-AFLP技术的概述,二. cDNA-AFLP的发明及其基础,由Vos于1995年创立 是用于RNA指纹分析的方法。 基于RT-PCR理论，依赖于3种技术 1）RT-PCR技术 2）AFLP技术 3）电泳技术,三、cDNA-AFLP的原理：,以纯化的mRNA为模板，反转录合成cDNA。用识别序列分别为6-bp和4-bp的两种限制性内切酶酶切双链cDNA，酶切片段与
6、人工接头连接后，利用与接头序列互补的引物进行预扩增和选择性扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,四.cDNA-AFLP目前的应用领域,主要用于RNA指纹分析等领域 鉴定未知基因 分离特异表达基因 基因表达特征的研究,五. cDNA-AFLP一般操作步骤,模板的制备和 cDNA 的合成 双链cDNA 片段的酶切和人工接头的连接 酶切片段的预扩增和选择性扩增 凝胶电泳分析,六. cDNA-AFLP的优点及缺点,反应条件严谨, 可靠性高, 重复性好 不需要预先知道序列信息 所需仪器设备简单,优点,cDNA-AFLP技术优点众多较为完善，但仍应注意的是内切酶（罕见切割酶，常见切割酶）和实验数据的分
7、析。,缺点,一、基因表达系列分析技术的概述,二. SAGE的发明及其基础,由Veleulescu于1995年创立 SAGE是一种快速分析基因表达信息的技术。 基于RT-PCR理论，依赖于3种技术 1）RT-PCR技术 2）DNA测序技术 3）酶切技术,三、SAGE的原理：,910 bp短标签(tag)是从一个转录本内分离得到，充分含有识别转录本的信息，因为10 bp(410)从理论上说已足够代表任何一个物种的转录产物，但其前提是假设生物体内的碱基序列是随机分布的；连接多个短标签，就能把多个tag集中到一个克隆中进行测序。,四.SAGE目前的应用领域,快速分析基因表达信息 转录图谱的构建 发现新
8、基因和基因的新功能,五. SAGE一般操作步骤,生物体特定阶段组织或细胞中全部mRNA的制备双链cDNA 片段的酶切和人工接头的连接 cDNA的双链的合成 锚定酶酶切 cDNA片段与接头（Linker）的连接 标签酶酶切释放标签序列 连接形成双标签（Ditages）,六.SAGE的优点及缺点,任何具备PCR和手动测序器具的实验室都能使用这项技术 结合自动测序技术能够在3个小时内完成1000个转录物的分析 可以使用不同的锚定酶，更具灵活性,优点,缺点,SAGE需要进行大量测序反应，费用昂贵。,一、微阵列技术的概述,二. 微阵列的发明及其基础,由Fodor等人于1991年首先提出DNA芯片的概念
9、是人类基因组计划（Human Geneome Project，HGP）的逐步实施和分子生物学的迅猛发展及运用的产物。 基于多种技术 1）Southern杂交技术 2）斑点杂交技术 3）融微电子学、生命科学、计算机科学和光电化学为一体,三、微阵列的原理：,微阵列是指在大规模集成电路所控制的机器人在尼龙膜或硅片固相支持物表面，有规律地合成成千上万个代表不同基因的寡核苷酸“探针”。这些“探针”可与用放射标记物如32P或荧光物如荧光素、丽丝胺等标记的目的材料中的DNA或cDNA互补核酸序列相结合，通过放射自显影或激光共聚焦显微镜扫描后，对杂交结果进行计算机软件处理分析，获得杂交信号的强度及分布模式图，以此反映目的材料中有关基因表达强弱的表达谱.,四.微阵列目前的应用领域,检测基因表达水平及识别基因序列 检测表达状况，发现新基因 检测突变和多态性进行遗传作图 DNA序列分析 药物研发,五. 微阵列一般操作步骤,芯片的制备 样品的制备 杂交反应 芯片信号的检测与分析,六.微阵列的优点,能够得到大量cDNA和EST序列 能够制作出高精度的微列阵系统 具有较高的分析速度和分析精度 具有网络化、微型化和自动化的特点,七.微阵列的缺点,目前极度缺乏公开可得的、序列经过证实的cDNA克隆和EST。限制了微阵列的发展和进步。 技术花费高昂 结果的判断分析仍存在技术问题,THANKS,
