《基因工程ppt课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程ppt课件（57页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1,基因工程的基本内容,2,基因工程的基本内容,引入 基因工程的概念 基因操作的工具 基因操作的基本步骤 小结,3,基因决定性状（一）,青霉菌能产生对人类有用的抗生素青霉素,4,基因决定性状（二）,家蚕能够吐出蚕丝为人类利用,5,基因决定性状（三）,豆科植物的根瘤能够固定空气中的氮,6,定向基因改造设想,设想一,能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？,能否让细菌“吐出”蚕丝？,设想二,能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？,设想三,经过多年的努力，科学家于20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术基因工程。,7,8,基因工程概念,基因工程：在生物体外，通过对DNA分子进行人工
2、“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出所需要的基因产物。,9,基因工程的特点,基因工程有两个基本的特点分子水平上的操作和细胞水平上的表达。 基因工程技术的诞生使人们能够在试管里进行分子水平上的操作，象一项工程那样，进行按图施工的操作，构建在生物体内难以进行的重组体，然后将重组的遗传物质引入相应的宿主细胞，让其在宿主细胞中进行工作。 这实际上是进行无性繁殖，即克隆，所以基因工程通常又称为基因克隆。,10,基因工程的对象是基因，所以如果是获得商品的话，就是基因的产品，或是改变了遗传性的细胞和个体。如果要获得效益的话，除了
3、经济效益之外，还有巨大的社会效益。 基因工程的对象是基因，而基因要安居才能乐业，也就是说基因需要在宿主细胞中工作。它需要在体外操作，然后送到细胞中去进行表现。,基因工程的特点,11,基因操作的工具,基因的剪刀限制性内切酶,基因工程过程示意图,基因的针线DNA连接酶,基因的运输工具运载体,12,基因工程过程示意图,从细胞中分离出DNA,13,基因克隆操作,14,限制性内切酶,分布：主要在微生物中。 特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。 结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。 举例：大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,15,一种限制酶只能识别一种特定的核苷
4、酸序列，并在特定的切割点上将DNA 分子切断。目前已发现的限制酶有200多种。,5,3,16,DNA连接酶,连接酶的作用：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。 连接的部位：磷酸二酯键，不是氢键。 DNA连接酶的作用过程,17,DNA连接酶的作用原理,18,DNA连接酶的作用过程,19,运载体,作用：将外源基因送入受体细胞。 条件： 能在宿主细胞内复制并稳定地保存。 具有多个限制酶切点。 具有某些标记基因 种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。 质粒的特点,要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工
5、具就是运载体。,20,质 粒,21,质粒的特点,细胞染色体外能自主复制的小型环状DNA分子； 质粒是基因工程中最常用的运载体； 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒； 存在于许多细菌及酵母菌等生物中； 质粒的存在对宿主细胞无影响； 质粒的复制只能在宿主细胞内完成。,22,基因操作的基本步骤,提取目的基因,目的基因与运载体结合,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测和表达一,目的基因的检测和表达二,23,提取目的基因,将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。,取 出DNA,用限制酶切断DNA,目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因
6、等。,24,提取目的基因的方法（一）,直接分离基因鸟枪法,将供体生物的DNA用限制酶切割为许多片段，再用运载体将这些片段都运载到受体生物的不同细胞中去。只要有一个细胞获得了需要的目的基因并得以表达，基因工程就算成功了。该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。,用限制酶切成许多片断,25,提取目的基因的方法（二）,人工基因合成法,逆转录法：以信使RNA为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成DNA(基因)。 直接合成法：根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使RNA核苷酸顺序，再据此推算出基因DNA的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相
7、应的基因。,DNA合成仪,PCR扩增仪,26,目的基因与运载体结合,用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成重组DNA分子。,提取质粒并用限制酶切割,用连接酶将目的基因和质粒连接,27,将目的基因导入受体细胞并扩增,基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物细胞等。 导入受体细胞常用的方法是借鉴细菌或者病毒侵染细胞的途径。通常还要对一些受体细胞进行增大通透性的处理。 目的基因可以随着受体细胞进行快速的繁殖，在很短的时间内获得大量的基因。,将目的基因导入受体细胞,将
8、受体细胞进行扩增,28,目的基因的检测和表达（一）,前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。,细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,29,目的基因的检测和表达（二）,多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。,例：用棉铃饲喂棉铃
9、虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,30,体外操作与细胞内表达,31,基因工程技术的诞生,1 基因工程的技术准备基因工程技术的诞生不仅依赖于基因分子生物学理论的发展，同时也有赖于一些重要的分子生物学研究方法的建立。最重要的技术准备是限制性酶的分离纯化、DNA连接酶的分离、大肠杆菌转化技术的突破。到1970年，这三大技术都已经建立，“万事齐备，只欠东风”了。到了19721973年，两位科学助产士Berg和Cohen将基因工程接到了人间。,32,基因工程技术的诞生,33,第一个重组体的构建1972年，美国斯坦福大学
10、P.Berg等在PNAS上发表了题为“Biochemical methode for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40:circular SV40 DNA molecules cotaining lamda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2904-2909, 1972”，标志着基因工程技术的诞生。,34,第一个重组体构建,35,SV40病毒是猿猴病毒，是一种直径
11、为450的球形病毒，分子量为28106道尔顿。SV40的DNA是环状双链结构，全长5243个碱基对。SV40DNA上有一个限制性内切酶EcoR的切点。,36,SV40病毒,37,当获得二聚体SV40DNA后，Berg等就证明了环状DNA被内切酶切成线性DNA后能够重新环化，并且能够同另外的分子重组。 于是他们进行第二步的实验就是从dvgal DNA中制备含有E.coli的半乳糖操纵子DNA，用上述同样的方法进行重组连接，并获得成功。,38,第一个有功能重组体的构建 虽然Berg的工作具有划时代的意义，但是他们并没有证明体外重组的DNA分子具有生物学功能。 1973年，Cohen等在美国PNAS
12、上发表了题为“Construction of Biologically Functional Bacterial Plasmid In Vitro” （S. N. Cohen, A. C. Y. Chang, H. W. Borer, and R. B. Helling, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:3240-3244, 1973）的论文，宣布体外构建的细菌质粒能够在细胞中进行表达,从而完善了Berg开创的基因重组技术。,39,Boyer and Cohen,40,质粒 pSC101的获得 In 1972, Cohen constructed a new pla
13、smid beginning with DNA isolated from E. coli. Cohen named the plasmid pSC101 (“SC“ for Stanley Cohen).The new plasmid had three important features: it had only a single recognition site where EcoRI would cut the molecule, thus identifying the spot where the plasmid would open; (2) it had a sequence
14、 of nucleotides called an origin of replication, which is needed to initiate DNA replication; such a sequence stimulates plasmids to multiply in a host organism; (3) it contained a gene for resistance to the antibiotic tetracycline; thus, bacteria having the plasmid could resist the effects of tetra
15、cycline, whereas bacteria lacking the plasmid would be killed by the tetracycline.,Cohen在重组DNA技术中杰出贡献,41,pSC101质粒DNA,42,质粒 pSC101对大肠杆菌的转化技术突破 Another key characteristic of Cohens plasmid was the ease of inserting it to a host cell. Cohen found that he could insert plasmids to fresh bacteria by suspe
16、nding the latter in cold calcium chloride, then rapidly heating the bacteria to 42oC. So treated, the bacterial wall and plasma membrane open to permit the plasmids to pass through and into the cytoplasm.,Cohen在重组DNA技术中杰出贡献,43,Cohen与Boyer合作创建重组DNA分子 To some historians, the discipline of DNA technolo
17、gy came into being over pastrami sandwiches at a local delicatessen in Waikiki Beach. The year was 1972. It happened that Herbert Boyer was at a scientific conference in Hawaii speaking about the EcoRl restriction enzyme. Stanley Cohen was in the audience. After the presentation, Cohen invited Boyer to lunch to explore their possible collaboration on a series of experiments. The two researchers sat and considered the experiments that would send DNA technology into a new era.,
