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1、1基因工程的基本操作程序 (1) 的获取。 (2) 的构建。 (3)将目的基因导入 。 (4)目的基因的 。,目的基因的获取,目的基因,基因表达载体,受体细胞,检测与鉴定,12 基因工程的基本操作程序,2目的基因的获取 (1)目的基因：主要是指 的基因，也可以是一些具有 的因子。 (2)常见方法： 从基因文库中获取 基因文库的种类,编码蛋白质,调控作用,基因组文库,cDNA文库,利用PCR技术扩增目的基因 a原理： 。 b条件： 、DNA模板、 、四种脱氧核苷酸。 c过程：目的基因DNA受热变性后解链为单链， 与单链相应互补序列结合，然后在 作用下进行延伸，如此重复循环多次。 d结果：每一次循
2、环后，目的基因的量可以 ，即成指数形式扩增(约为2n，n为扩增循环的次数)。 人工合成法：如基因比较小， 又已知，可借助 用化学方法直接人工合成。,DNA双链复制,引物,Taq酶,引物,DNA聚合酶,增加一倍,核苷酸序列,DNA合成仪,思维激活1 PCR过程中，需要解旋酶吗？所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？ 提示 PCR过程中，DNA双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶；由于PCR过程温度较高，所以需要能耐高温的DNA聚合酶。,1提取目的基因方法的比较,2PCR技术与DNA复制的比较,特别提醒 (1)真核细胞的基因编码区含有不能表达的内含子，因此，不能直接用于基因的扩增和表达。获得真核细
3、胞中目的基因时，一般用人工合成的方法。 (2)PCR扩增的过程：目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应的互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环多次。由于延伸后得到的产物同样可以和引物结合，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一培，即成指数形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环的次数)。,【巩固1】 下列获取目的基因的方法中需要模板链的是 ( )。 从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 反转录法 通过DNA合成仪利用化学方法人工合成 A B C D,解析 PCR利用的是DNA双链复制原理，即将双链DNA之间的氢键打开，变成单链DNA，作为聚合反应的
4、模板。反转录法则是以目的基因转录成的信使RNA为模板，在逆转录酶的作用下，先反转录形成互补的单链DNA，再合成双链的DNA。、则均不需要模板。 答案 D,1基因表达载体的构建 (1)基因表达载体的组成 启动子 位置：基因的首端。 功能：是 识别和 结合的部位，驱动基因转录出 。,基因表达载体的构建与转化,RNA聚合酶,mRNA,终止子 位置：基因的尾端。 功能：使 在所需要的地方停止下来。 标记基因：鉴别受体细胞中是否含有 。 (2)基因表达载体的功能 使目的基因在受体细胞中 ，并且可以遗传给下一代，使目的基因能够 和发挥作用。 (3)基因表达载体的构建 一般用同一种限制酶分别切割载体和目的基
5、因，再用DNA连接酶把两者连接。,转录,目的基因,稳定存在,表达,2将目的基因导入受体细胞 (1)转化的概念 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内 的过程。 (2)将目的基因导入植物细胞 法：将目的基因导入双子叶植物和祼子植物。 法：将目的基因导入单子叶植物常用的方法。 法：我国科学家独创的一种方法。,维持稳定,和表达,农杆菌转化,基因枪,花粉管通道,(3)将目的基因导入动物细胞 方法： 法。 常用受体细胞： 。 (4)将目的基因导入微生物细胞 第一步：首先用Ca2处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为 细胞。 第二步：将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液
6、中与感受态细胞混合，在一定温度下促进感受态细胞吸收 ，完成转化过程。,显微注射,受精卵,感受态,DNA分子,思维激活2 为什么微生物细胞适合作为基因工程的受体细胞？ 提示 微生物细胞具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少的优点，因此是基因工程常用的受体细胞。,1基因表达载体的构建步骤 (1)一般用同一种限制酶切割目的基因和质粒，使其产生相同的末端。 (2)将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成一个重组DNA分子(重组质粒)。构建过程(如下图)。,2将目的基因导入受体细胞的方法比较,特别提醒 (1)基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。 (2
7、)对于植物来说，受体细胞可以是受精卵和体细胞，但常用体细胞。 (3)对于动物来说，受体细胞一般是受精卵。受精卵作为受体细胞具有体积大、易操作、经培养可直接表达性状的优点。而动物体细胞的全能性受限。,【巩固2】 请据图回答下列问题。 (1)基因工程的核心步骤是_。 (2)利用_技术可以获得大量的目的基因。该技术利用_的原理，将基因的核苷酸序列不断加以复制，使其数量呈指数增长。 (3)图中_位于目的基因的首端， 是_识别和结合的部位。抗生 素抗性基因的作用是作为_， 用 于鉴别受体细胞中是否导入了目的 基因。,解析 本题考查基因表达载体的组成及其构建。基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建；目的基
8、因的获取方法很多，其中PCR技术能迅速获得大量目的基因，其依据的原理是DNA双链复制原理；基因表达载体必须包含目的基因、启动子、标记基因、终止子，其中启动子位于目的基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录为mRNA，抗生素抗性基因作为标记基因用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因。 答案 (1)基因表达载体的构建 (2)PCR DNA双链复制 (3)启动子 RNA聚合酶 标记基因,1分子检测 (1)检测转基因生物的染色体上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。 方法： 技术(DNA探针转基因生物 )。 结果：如果显示出杂交带，就表明目的基因 。 (2)检测
9、目的基因是否转录 方法： 技术(DNA探针转基因生物 )。 结果：如果显示出杂交带，则表明目的基因 。,目的基因的检测与鉴定,DNA分子杂交,DNA,已插入染色体DNA中,分子杂交,mRNA,转录出了mRNA,(3)检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法： 。 结果：若有杂交带出现，则表明目的基因 。,抗原抗体杂交,已形成蛋白质产品,接种,2个体水平鉴定 包括抗虫、抗病的 实验，以确定是否有抗性及抗性程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。,思维激活3 进行目的基因导入及转录检测时，均用到DNA探针，该探针的脱氧核苷酸序列如何？其检测依据是什么？ 提示 把“目的基因片段”进行放射性同位素标
10、记或进行荧光标记，用标记好的基因片段做探针，与受体生物的基因组DNA进行杂交，如果有杂交带出现，根据分子杂交的基本原理，说明目的基因与受体细胞基因组DNA具有同源性，也就是说目的基因已经被导入受体细胞内，反之，则说明目的基因没有进入受体细胞中。,目的基因导入受体细胞的结果分析,说明：上图中发生与发生相比，会使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达，原因是在进行细胞分裂时，细胞核上的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中，保证了亲子代遗传性状的稳定性，而细胞分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因。,【巩固3】 目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才
11、能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是 ( )。 检测受体细胞是否有目的基因 检测受体细胞是否有致病基因 检测目的基因是否转录mRNA 检测目的基因是否翻译蛋白质 A B C D,解析 目的基因的检测包括：首先检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是用DNA探针，使DNA探针与基因组DNA杂交；其次检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是用基因探针与mRNA杂交；最后检测目的基因是否翻译了蛋白质，方法是进行抗原抗体杂交。,【例1】 水稻种子中70%的磷以植酸形式存在。植酸易同铁、钙等金属离子或蛋白质结合排出体外，是多种动物的抗营养因子，同时，排出的大量磷进入水体易引起水华。为从
12、根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流程。,目的基因的获取,据图回答下面的问题。 (1)图中基因组文库_(填“小于”“等于”“大于”)cDNA文库。 (2)B过程需要的酶是_； A、C过程中_(填“可以”“不可以”)使用同一种探针筛选含目的基因的菌株。 (3)目的基因和除从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中_和_为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是_。,思维导图：,深度剖析 基因组文库包含本物种全部遗传信息，cDNA文库仅包含部分遗传信息；由mRNA构建cDNA文库需逆转录酶，筛选目的基因时，可用同一种探针对
13、由基因组文库或cDNA文库中获取的目的基因予以检测，若通过PCR技术扩增目的基因，可利用DNA或cDNA作为模板，该扩增过程需耐高温的DNA聚合酶参与。 答案 (1)大于 (2)逆转录酶 可以 (3)DNA cDNA 耐高温,【例2】 1抗胰蛋白酶缺乏症是北美常见的一种单基因遗传病，患者成年后会出现肺气肿及其他疾病，严重者甚至死亡。利用基因工程技术将控制该酶合成的基因导入羊的受精卵，最终培育出能在乳腺细胞表达人1抗胰蛋白酶的转基因羊，从而更容易获得这种酶。,基因表达载体的构建与转化,下列关于该过程的叙述中错误的是 ( ) A载体上绿色荧光蛋白基因(GFP)的作用是便于筛选含有目的基因的受体细胞
14、 B将目的基因导入羊膀胱细胞中，将会更加容易得到1抗胰蛋白酶 C培养出的转基因羊的所有细胞中都含有该目的基因，故该羊有性生殖产生的后代也都能产生1抗胰蛋白酶 D目的基因与载体重组过程需要DNA连接酶的催化作用,思维导图：,深度剖析 基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等；将目的基因导入动物细胞，常以受精卵作为受体细胞；将目的基因与载体结合，需要DNA连接酶的催化作用。 答案 C,思维拓展 基因表达载体的几个关键组成的作用： 标记基因便于筛选；目的基因使转基因生物获得我们所需的性状；启动子启动目的基因的转录；终止子终止目的基因的转录；复制原点使DNA复制以便于进行表达载体的扩增。另外，一般情况下常用同一种限制酶切割目的基因和载体，以便于表达载体的构建，但是特殊情况下，用不同的限制酶切割目的基因和载体，如果切出的黏性末端相同，也是可行的。,【例3】 在判断抗虫基因是否成功转入棉花基因组的方法中，不属于分子检测的是 ( )。 A通过观察害虫吃棉叶是否死亡 B检测目的基因片段与DNA探针能否形成杂交带 C检测目的基因转录形成的mRNA与DNA探针能否形成杂交带 D检测目的基因表达产物蛋白质能否与特定抗体形成杂交带,
