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1、2018/9/18,1,第七章 基因结构与表达分析 的基本策略,2018/9/18,2,一、双脱氧链末端终止法,第一节 DNA序列分析,二、DNA自动化序列分析,三、化学裂解法,2018/9/18,3,一、双脱氧链末端终止法 （dideoxy chain termination）,掺入N个核苷酸,DNA合成反应,2018/9/18,4,ATP、dATP和ddATP的结构,2018/9/18,5,末端终止部位,DNA单链模板,引物,延伸的新合成链,掺入ddNTP,2018/9/18,6,2018/9/18,7,DNA测序技术基础：,高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide g
2、el electrophoresis, PAGE）。 PAGE能分离长度为300500个碱基，差别仅1个碱基的单链寡核苷酸DNA片段。,2018/9/18,8,末端终止测序反应产物电泳区带放射自显影图,2018/9/18,9,2. DNA测序主要步骤,已知序列,未知序列,变性,模板-引物退火,标记反应,延伸-终止反应,测序引物,测序引物延伸,CCTAGGCT GGATCCGA,GGATCCGA,GGATCCGA,A反应管,GGATCCGA,G反应管,C反应管,T反应管,ddATP & dNTPS,ddGTP & dNTPS,ddCTP & dNTPS,ddTTP & dNTPS,5 3,5 3
3、,5 3,3,5,单链模板,5,5,3 5,待测双链 DNA,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,放射自显影,阅读分析结果,2018/9/18,10,ddCTP,ddATP,ddTTP,ddGTP,dCTP,dATP,dTTP,dGTP,5 T,G A A T G A 3,A,C,G,C,T,二、DNA自动化序列分析,2018/9/18,11,用荧光化合物分别标记4种ddNTP终止反应产物，替代放射性同位素标记是实现DNA测序自动化的基础。,2018/9/18,12,DNA自动测序步骤,4种带有不同荧光染料标记的终止物ddNTPs,Sanger测序反应,反应产物毛细管电泳分离,激光激发不同大小DNA片段上
4、的荧光分子， 发射出四种不同波长的荧光,荧光信号采集、计算机分析与DNA自动排序。,2018/9/18,13,三、化学降解法,将待测DNA片段3或5端进行同位素标记，标记的DNA片段分成四个反应，分别用不同的化学试剂处理，造成碱基特异性切割，使DNA片段分别于某一种碱基处断裂。,2018/9/18,14,化学降解G反应模式图,Met,Met,Met,Met,2018/9/18,15,一、PCR技术原理,第二节 聚合酶链式反应,(Polymerase Chain Reaction,PCR),二、耐热DNA聚合酶,三、PCR引物设计原则,四、PCR条件的优化,五、PCR改进技术,2018/9/18
5、,16,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,DNA模板 引物 dNTP DNA聚合酶 Mg2+,一、PCR技术原理,2018/9/18,17,2018/9/18,18,PCR引物： 单链DNA片段,提供DNA复制起始的3-OH。,Cycle One,2018/9/18,19,比两引物限定区长的延伸产物。仅发生在以原始DNA为模板的扩增过程中，以倍数形式扩增(2n)。,引物延伸产物,Cycle Two,2018/9/18,20,PCR扩增终产物大小,介于两条退火引物5末端之间的双链DNA片段。,Cycle Three,2018/9/18,21,2018/
6、9/18,22,PCR原理,变性,延伸,退火,DNA模板 引物 dNTP DNA聚合酶 Mg2+,PCR是模拟天然DNA复制过程，利用DNA聚合酶催化一对引物间特异DNA片段合成的体外扩增技术。 主要热循环过程：变性、退火、延伸。,2018/9/18,23,Y=A（1+E）n Y: 扩增产物的量 A: 最初靶DNA分子数 E: PCR扩增效率 n: 循环次数,PCR扩增产物的量,2018/9/18,24,平台效应（plateau effect）：,PCR经过一定数量的循环后，DNA片段不再呈指数累积，而是进入平台期。,2018/9/18,25,二、耐热DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶大片段
7、（Klenow片段） ： 热稳定性差，不耐高温。 反应温度偏低，产生非特异扩增。,T4 与T7 DNA聚合酶:热稳定性差。,2018/9/18,26,Taq DNA聚合酶,从嗜热水生菌(Thermus aquatics YT-1) 株中直接分离出来。,较高的热稳定性：,95的半衰期: 40 min 最适温度: 72 80 催化反应速率: 150300核苷酸/秒/酶分子,2018/9/18,27,Taq DNA聚合酶特性, 53聚合酶活性； 53外切酶活性； 逆转录酶活性； 较弱的非模板依赖性； 缺乏35外切酶活性。,2018/9/18,28,PCR自动化的实现,PCR热循环：,高温变性（939
8、8）,低温退火（3765）,中温延伸（7075）,2018/9/18,29,PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析,500bp,400bp,200bp,300bp,1000bp,600bp,700bp,800bp,900bp,Markers,PCR产物,2018/9/18,30,基本原则： 1. 引物与模板的序列要完全互补 2. 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 3. 引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(错配),三、PCR引物设计原则,2018/9/18,31,5CACTGAACGTAGGCCT3,3GCAGGTTCAGTGACTTGCATCCGGATGCAAC5,特异扩增,1.
9、 引物与模板的序列要紧密互补,2. 引物不能在模板的非目的位点引发 DNA聚合反应(错配),2018/9/18,32,引物之间应避免3端互补,3.引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构,2018/9/18,33,引物自身不应形成发夹结构,2018/9/18,34,4.其它原则:, 引物长度: 1030 nt, 碱基分布: A、T、G、C 随机分布, G+C含量：40 60% Tm=4(G+C)+2(A+T), 引物3末端碱基：最好选T、C、G，不选A,避免出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC, 引物5末端碱基可不与模板DNA互补,2018/9/18,35,2018/9/18,36,1
10、 A260 oligo DNA33g N: 引物碱基数 X：合成的oligo DNA A260单位 Y：引物的pmol数,106 Y（pmol）= X33 330 . N X = 105 N,PCR引物用量计算,2018/9/18,37,四、PCR条件的优化,(一) Taq DNA聚合酶浓度： 1.02.5 U/100 l反应液,(二) dNTP浓度：20200 mol/L,(三) Mg2+浓度：0.52.5 mmol/L,(四) 引物浓度：0.10.5 mol/L,2018/9/18,38,五、PCR改进技术,1. RT-PCR(reverse transcription PCR),以mRN
11、A为模板逆转录合成cDNA，再以此cDNA为模板进行PCR反应。,2018/9/18,39,2. 实时荧光定量PCR,实时PCR应用：用于基因DNA拷贝数和mRNA表达定量分析。,通过起点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度，对产物实时定量的PCR技术。,2018/9/18,40,荧光染料,荧光标记方法,2018/9/18,41,SYBR Green I 作用机理,每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去，染料一结合，就产生荧光信号，信号强度与DNA分子数目成正比。,2018/9/18,42, TaqMan Probe,寡核苷酸探针的5端标记一个荧光报告基团（reporter ），3
12、端标记一个荧光淬灭基团（quencher ）。,每产生一条DNA链，就切断一条探针，同时产生一个单位荧光信号，信号强度与结合探针的DNA分子数成正比。,2018/9/18,43, Molecular Beacon Probe,探针具有发夹结构，5端标记荧光报告基团，3端标记淬灭基团。,2018/9/18,44,探针与靶序列杂交结合，报告荧光染料与淬灭染料分离，发出荧光。,2018/9/18,45,Cycle,终点DNA量是经过PCR扩增的量，存在部分失真，起点定量重现性好，终点定量误差大。,2018/9/18,46,基线：扩增曲线中的水平部分，为空白或 背景信号。,2018/9/18,47,阈
13、值（临界点）:,PCR扩增信号进入指数增长期的最下限， 即由基线期进入指数增长期的拐点。,2018/9/18,48,CT值:,从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数。,2018/9/18,49,CT值与DNA0的关系,2018/9/18,50,标准曲线：CT值对DNA0作图,2018/9/18,51,3. 反向PCR（inverse PCR）,用限制性内切酶A消化,用T4DNA连接酶环化,用限制性内切酶B消化,对已知片段两侧的未知序列进行扩增和研究。,2018/9/18,52,4. Alu-PCR,利用Alu高度保守序列设计引物扩增哺乳动物未知DNA片段的方法。,2018/9/18,53,5.
14、 原位PCR (in-situ PCR),制备细胞 多聚甲醛固定 蛋白酶K消化,原位RT-PCR 地高辛标记 RT-PCR,产物检测 与地高辛抗体杂交,2018/9/18,54,6. 巢式PCR（nested PCR）,设计两对引物，一对引物对应的序列在模板外侧，称外引物，另一对引物互补序列在同一模板的外引物的内侧，称内引物，外引物扩增产物为内引物的扩增模板，经过二次PCR，可检出低拷贝原始模板。,2018/9/18,55,7. 不对称PCR（asymmetric PCR）,扩增产生特异长度的单链DNA。,2018/9/18,56,8. cDNA末端快速扩增技术,2018/9/18,57,9.
15、 PCR单链构象多态性 （PCR-single strand conformation polymorphism, PCR-SSCP）,2018/9/18,58,第三节 核酸分子杂交,（Nucleic Acid Hybridization ）,三、Northern印迹杂交,一、核酸分子杂交原理,二、Southern印迹杂交,2018/9/18,59,核酸分子杂交是指两条互补单链核酸在一定条件下按碱基。,一、核酸分子杂交原理,2018/9/18,60,(一) 印迹技术 利用各种物理方法使电泳中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。,（二）探针标记技术 用放射性核素、生物素或荧光素染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链称为探针。,2018/9/18,61,二、Southern印迹杂交(Southern blotting),将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。,用于DNA定性、定量分析。,2018/9/18,62,1. 制备基因组DNA 2. 用限制性内切核酸酶消化基因组DNA 3. 琼脂糖凝胶电泳分离DNA酶切片段 4. 凝胶预处理 5. Southern 印迹转移 6. 标记核酸探针、探针与DNA片段杂交 7. 杂交结果显示,Southern印迹杂交基本过程,2018/9/18,
