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1、分子生物学与生物化学实验 操作、设计与技能,PCR技术的原理及应用（一） 李刚 副教授,contents,末代沙皇尼古拉二世、1918年的流行性感冒病毒、电影侏罗纪公园，以及辛普森杀妻案，这四件事情到底有什么相关？,答案是没有。只不过近十几年来生物技术的一项新发明，把它们给连在一块了。这项技术就是“聚合酶链反应”（polymerase chain reaction，PCR）。,Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应、分子克隆及DNA序列分析这三大类实验方法几乎构成了现代分子生物学的实验工作的基础。而三者中，PCR方法在理论上出现最早，在实践中应用得最广泛。,国际象棋
2、与PCR,国际象棋的发明者，要了一个简单的、天文数字的奖励。这种奖励方式在几千年后引起了一个生物技术的革命。,PCR技术的故事,有时侯一个创造性的灵感在你不经意中突然浮现出来。在1983年4月的一个星期五的晚上，通过一个令人难以置信的天真的甚至幸运的错误巧合，我获得了一个重大的发现。那天晚上我正在紧握轿车的方向盘，在一条被月光笼罩的通向北加利福尼亚红树县的山路上蜿蜒前行。这个重大发现就是我偶然想到的有关不受限制地制造大量的基因拷贝的过程，这个过程现在称为聚合酶链式反应（PCR）。 K. B. Mullis The unusual origin of the polymerase chain r
3、eaction (SCI. Am. 262:56 1990),PCR 技术发展的历史（1）,PCR技术起始于20世纪70年代早期,由Khorana与他的同事最先提出建议，作为一种降低化学合成基因工作量的策略。然而，在基因序列分析方法尚未成熟，热稳定DNA聚合酶尚未报道以及寡核苷酸引物合成尚处于手工及半自动合成阶段，用聚合酶链式反应大量合成基因的想法似乎是不切合实际的。,PCR 技术发展的历史（2）,15年后，Kary Mullis及他的Cetus公司的同时们，首次报道了用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段体外扩增哺乳动物单拷贝基因。虽然如此，在热稳定DNA聚合酶尚未发现之前， PCR可能
4、还是一种笨拙的中看不中用的实验室方法。1988年，一种从嗜热水生菌来源的热稳定DNA聚合酶的应用，大大增加了PCR的效率，并且使PCR方法趋于自动化。,PCR 技术发展的历史（3）,到20世纪80年末，克隆已不再是分离基因的唯一方法，DNA测序已取得了革命性的进展，PCR已经成为遗传与分子分析的根本基石。到今天，PCR方法已经衍生出许许多多新的方法，成为一门专门的学科。由于发明了PCR技术，1993年，Mullis 获得了诺贝尔化学奖！,PCR反应的七种基本成份,热稳定DNA聚合酶。 一对特异的引导DNA合成的寡核苷酸引物。 dNTP（混合液：标准PCR反应包含4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，
5、即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。 二价阳离子。所有的热稳定DNA聚合酶都要求有游离的二价阳离子，通常是Mg2+用于激活。 一价阳离子。标准PCR缓冲液内包含有 50 mmol/L的KCl，它对于扩增大于500 bp的DNA片段是有益的，提高KCl浓度在约70100mmol/L范围内对改善扩增较短的DNA片段产物是有利的。 模板DNA。含有靶序列的模板DNA科研单链或双链形式加入PCR混合液中。闭环DNA模板的扩增效率略低于线性DNA。尽管模板DNA的长短不是PCR扩增的关键因素，但当使用高分子量的DNA（10kb）作模板时，如用限制性内切酶先行消化（此酶不应切割其中的靶序列），则扩增
6、效果更好。,聚合酶链式反应的过程,PCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。一般由三个步骤组成：模板的热变性，寡核苷酸引物复性到单链靶序列上以及由热稳定DNA聚合酶催化的复性引物引导的新生DNA链延伸聚合反应的过程。,PCR实验的视频,变性温度的选择,在应用Taq DNA聚合酶进行PCR反应时，变性往往是在94C95 C进行，这是Taq DNA聚合酶进行30个或30个以上PCR循环而活力不致受到过多损失时所耐受的最高温度。在PCR的第一个循环中，有时常把变性时间设计为5min，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。但根据现在的经验，对于线性DNA分子而言，这种延长变性时间是没有必要的，而
7、且在有些时候还是有害的。对于GC为55或更低些的线性DNA模板我们推荐常规的PCR的变性条件是94C95 C变性45s。 当模板DNA的GC%超过55时需要更高的变性温度。来源于古细菌的DNA聚合酶比Taq DNA聚合酶更能耐受高温，因此更适合用来扩增富含GC的DNA模板。,熔解温度的计算,有几个公式可用来计算寡核苷酸与其靶序列形成的杂合分子的熔解温度。但没有一个是尽善尽美的。最常用的两个如下： 1、Wallace规则：是一个根据经验确定的简便的计算公式，可用来计算长为1520个碱基的引物在高离子强度额溶液中（如1M NaCl）形成完全互补配对时的熔解温度： Tm C 2 （AT）4（GC）
8、公式中AT为核苷酸中A和T残基的数目，GC为G和C残基的数目。 2、Tm/ C=81.5 C+16.6(lg k+)+0.41%(G+C)-(675/n) 能够合理预测一条长度为1470个核苷酸的引物在小于或等于0.4M的阳离子溶液中的熔解温度。 在上述公式中，n是寡核苷酸引物的碱基数。该公式还可用来计算序列和大小都已知的扩增产物的熔解温度。 现在很多引物设计软件可帮助你精确计算出PCR引物的Tm值的大小。,复性温度的选择,复性（退火）采用的温度至关重要。如果温度太高，寡核苷酸引物不能与模板很好地复性，扩增效率将会非常低。如果复性温度太低，引物将产生非特异性复性，从而导致非特异性的DNA片段的
9、扩增。复性通常在比理论计算的引物和模板的溶解温度低35 C的条件下进行。目前没有一个公式适用于所有长度和不同序列的寡核苷酸引物。最好通过对复性温度比两条寡核苷酸引物的熔解温度低210 C范围内进行系列PCR预实验来对复性条件进行优化，或者可控制PCR仪在连续的循环中逐渐降低复性温度来确定最佳复性温度，即降落PCR（Touchdown PCR或梯度PCR）。降落PCR只需要一次PCR就可以对复性温度进行优化，因此常被用于常规PCR的扩增反应。,寡核苷酸引物的延伸,常在热稳定DNA聚合酶的催化DNA合成的最适温度下进行，对Taq DNA聚合酶来说最适温度一般为72 C78 C。在最适温度下，Taq
10、 DNA聚合酶的聚合速率约为2kb/min，但作为一个由经验确定的规则，靶基因的每1000bp的扩增时间被设定为1min,依此类推。对于PCR的最后一个循环，许多研究者常把延伸时间增加为以前循环的延伸时间的3倍以上。从表面上看，这可以使所有的扩增产物完成延伸，但是根据现在的经验，PCR的结果并不因为延伸时间的延长而得到明显的改观。,循环数目,PCR扩增所需的循环数目取决于反应体系中起始模板的拷贝数以及引物延伸和扩增的效率。一旦PCR反应进入几何级数增长期，反应会一直持续下去，直至某一成分成为限制因素。从这一点上说，扩增产物中应该绝大多数是特异性的扩增产物。用Taq DNA聚合酶在一个含有105
11、个拷贝的靶序列的反应体系中进行30个循环后往往可以达到上述理想情况。以含有单拷贝的哺乳动物DNA为模板至少需要25个循环才能得到足够量的扩增产物。一般PCR反应扩增的循环数在3035之间，偶尔会达到40个循环。,聚合酶链式反应中的可选成分,有研究表明，使用一些共溶剂和添加剂能够降低高水平的错误引导与提高富含GC模板的扩增效率。共溶剂包括甲酰胺（1.25%-10% V/V）, 二甲基亚砜（DMSO，最高可达15 V/V）和甘油 （110 V/V）。添加剂包括氯化四甲铵，谷氨酸钾（10200mM），硫酸铵，非离子的和阳离子的去垢剂和一些尚未被鉴定的“特异性的增强剂”，如Stratagene公司的P
12、erfect Match聚合酶增强剂和Clonetech公司的GCMelt。在高浓度时，许多添加剂和共溶剂都可以抑制PCR，对不同浓度的引物和模板DNA的组合都应该通过经验确定其最适浓度。 当PCR反应出现问题时，首先考虑的不是使用这些增强剂，而应该是对反应体系里的控制成分进行优化，尤其是Mg2+和K+的浓度。这个普遍规律的一个例外是GCMelt的应用，它常常能够克服和解决对富含GC的模板扩增时效率低下的问题。,抑制剂,PCR反应体系中任何成分的过量都可能成为抑制PCR反应的因素。常见的抑制剂有蛋白酶K，苯酚，EDTA。其他的一些物质，如离子型去垢剂，肝素，精胺，血红蛋白和上样凝胶中的染料如溴
13、酚蓝和二甲苯蓝。 在许多情况下，引起扩增产率过低或者错误的扩增产物的主要原因是模板DNA中含有污染物，而模板DNA常常是惟一由研究者提供的反应成分。通过对模板DNA进行透析，乙醇沉淀，氯仿抽提，和或用树脂进行层析等进化处理后即可解决PCR过程中遇到的许多问题。,PCR引物的设计（1）,1、碱基组成： GC含量应在40到60之间，4种碱基要在引物中分配均匀。 2、长度： 引物中与模板互补的区域应该1825个核苷酸长度。上下游引物的长度差别不能大于3bp。 3、重复和自身互补序列： 不能有大于3bp的重复序列或自身互补序列存在。这种序列可形成发夹结构，如果这种结构在PCR条件下稳定，它会非常有效地
14、阻止寡聚核苷酸和靶DNA之间的复性。 4、上下游引物的互补性： 一个引物的3端不允许结合到另一个引物的任何位点上。因为在PCR中引物的浓度往往是比较高，所以即使引物间微弱的互补，都会导致引物间形成杂交，随后是引物二聚体的形成和扩增。如果引物二聚体在PCR早期形成，它将和DNA聚合酶、引物及核苷酸竞争进而抑制靶DNA的扩增。精心进行引物设计，应用热启动PCR或降落PCR或特制的DNA聚合酶（如： AmpliGold，PerkinElmer）都可以避免引物二聚体的形成。当在一个PCR中应用多对引物时，请注意检查任何一个3末端都不能和其他任何引物互补。,PCR引物的设计（2）,5、解链温度（Tm）：
15、 计算出来的两个引物的Tm值相差不能大于5 C。扩增产物的Tm值与引物的Tm值相差不能大于10 C。这些特性保证了扩增产物在每个PCR循环可有效地变性。 6、3末端： 3末端额性质非常关键。如果可能的话，每个引物的3末端碱基应为G或C，不能为A。然而，并不推荐使用3端有NNCG或NNGC序列的引物，因为末端GC碱基高的自由能可以促进发夹结构的形成，还可能产生引物二聚体。 7、向引物的5端添加限制性酶切位点，噬菌体启动子等序列：有用而又不与靶DNA序列互补的序列一般加到引物的5末端。一般来说，这些序列的存在不会显著地影响寡核苷酸和靶DNA之间的复性。这些附加序列包括噬菌体启动子和GC夹子。限制性
16、酶切位点是一个特殊情况。因为位于DNA分子5末端的限制性酶切位点的切割效率比较低，所以引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个核苷酸。,PCR引物的设计（3）,8、引导位点的设置： 根据实验的不同目的，引导位点的设置可能会受到突变位点、限制性内切酶位点、编码序列、微卫星序列和顺式作用元件的影响。当针对cDNA模板设计引物时，正向和反向引物最好结合到不同外显子的不同区域。这些可以很容易地把来源于cDNA的扩增产物和来源于污染的基因组DNA的扩增产物区分开。 9、简并PCR的引物： 当通过对纯化的蛋白质测定其一短段的氨基酸序列后， 对该氨基酸序列的包含所有可能的编码组合的寡核苷酸简并库可用于扩增相
17、应的基因组或cDNA序列。,PCR引物的选择,1、对靶基因中潜在的引物位点进行分析，这些位点应该不会形成同源多聚体结构，也没有明显的形成二级结构的趋势，不会自身互补，与基因组中的其他序列无显著的同源性。 2、 根据上述原则列出一系列可能的正向和反向引物。根据寡核苷酸引物与其靶序列形成杂合分子的熔解度的计算中提供的公司计算各引物的熔解温度。 3、选择一对匹配完好的正向和反向引物。两条引物的GC含量相似，两条引物的GC含量都应在4060之间。 4、对寡核苷酸的长度和或位置进行细调。使得引物的3末端核苷酸为G或C。检查两条寡核苷酸之间有无明显的互补性。作为一条经验性的规律，一条引物上不应该含有三个连续的与另一个引物互补的核苷酸。,
