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1、发酵过程优化与放大概论,华东理工大学 国家生化工程技术研究中心（上海） 庄英萍,第一部分,生物反应器过程的多尺度理论发酵过程优化与放大基础,本章提要,生物反应器过程的多尺度理论发酵过程优化与放大基础 发酵过程优化控制中的方法和手段 发酵过程优化控制举例,第一部分,生物反应器过程的多尺度理论发酵过程优化与放大基础,仍旧局限于寻求培养基配方和最佳的温度、pH、DO等 缺乏微观的实时的代谢调控,代谢调控研究 代谢工程研究,发酵过程酶学 研究的困难,过程数据采集 和处理的困难,发酵工艺优化研究 的基本思路,单一生理调控机制，缺乏全局性的概念,测量参数及其变化的意义缺乏理解 最佳工艺控制点为依据的静态操
2、作方法，只是化学工程宏观动力学概念在发酵工程上的简单延伸 缺乏以细胞代谢流分析与控制为核心的研究内容,背景和原理,不同尺度的网络状态关系,生命所特有的信息流、物质流、能量流 具有“变化着的结构” 不仅是线性或动力学因素 跨尺度测量与控制 往往以各自研究的技术背景从单一尺度去理解和分析研究生物过程的特点,呈网络多输入多输出关系,不是简单的统计热力学关系 网络结构表现在不同尺度的网络状态的互动关系 多输入多输出关系 信息流、物质流和能量流， 生命属性所特有的时空串联反应关系 微生物代谢流 网络研究的的核心问题,具有“变化着的结构”,当生物反应器尺寸或操作条件变化时，发生的结果变化不是简单的用线性关
3、系或平均统计方法所能描述的物质状态的变化。 导致过程变化的原因除了线性或动力学因素之外，往往还发生在系统结构性的突变。,跨尺度观察与操作,工业规模的生物过程只能在反应器尺度上进行测量与操作 可以从低一尺度层次的规律或性质，来预测研究另一尺度层次的规律或性质 多尺度综合与各子过程的相互量化关系，澄清不同尺度间相互作用和耦合的原则和条件 跨尺度操作是难题，分析跨尺度问题往往需要纳入跨学科和跨技术的手段,第二部分,发酵过程优化控制中的方法和手段,数据驱动型方法,复杂性 多容量过程 高度非线性,线性或拟线性关 系的数学摸型,发酵生产完整过程,发酵过程参数趋势曲线相关,数学模型、静态和动态优化、系统识别
4、、自适应控制、专家系统、模糊控制、神经元网络、各种混沌现象的研究,困难,跨尺度观察,方法和装备技术研究,基本方法, 基于参数相关的发酵过程多水平(尺度)问题研究的优化技术 发酵过程多参数调整的放大技术,用于发酵过程数据优化与放大的专用装置,以生物反应器中 的观点，在实验室规模发酵罐，具有十四个以上发酵过程在线参数检测或控制。 在原理上与现有国内外生物反应器有重大区别。,物料流检测,专门用于发酵过程优化与放大 研究用的FUS-50L(A)发酵罐,软件设计,BlORADAR。,关键技术,计算机控制与数据处理软件包,适应多种反应器特点，融合多种过程理论和控制理论， 便于发酵过程工艺分析和优化操作。,
5、代谢曲线对照,发酵过程的参数相关分析,参数曲线相关分析的优势,从发酵过程多尺度系统理论来看，参数趋势曲线相关有可能是某一尺度的线性或动力学行为，也可能是多尺度系统的结构性突变，因此用常规的单一尺度模式有时就无法解释过程中发生的许多现象。 虽然这些过程检测大多是环境中的状态或操作量，但可以通过进一步分析，得到反映分子、细胞和反应器工程水平的不同尺度问题的联系，从而实现跨尺度观察和跨尺度操作。,参数相关耦合的定义,参数耦合相关是指各种直接参数、间接参数以及实验室手工参数随着发酵过程的进行而变化，并且参数间发生某种耦合相关。 这种参数相关是生物反应器中物料、能量或信息传递、转换、以及平衡或不平衡的结
6、果，其微观因素也许只是发生在基因、细胞或反应器工程水平的某一个尺度上，但最终会在宏观过程中有所反映，这就为我们研究生物反应器中不同尺度的数据关联分析方法提供了线索。,发酵过程参数检测的意义,可以得到反应细胞尺度、分子尺度和工程尺度的反应特性，并通过分析而加以区分不同尺度的问题； 可以了解发酵过程各参数之间的多样性、时变形、相关耦合性和不确定性，了解复杂的发酵过程 通过参数的检测，可进一步优化发酵工艺，最终提高产品的生产产量。,参数相关基本特性,各种直接参数、间接参数以及手工测定的实验室参数随着发酵过程的进行而变化，并且参数间发生某种耦合相关，这种参数相关反映了发酵过程多尺度（水平）的问题特征。
7、,发酵过程检测参数的特性,所检测到的参数均是动态平衡的结果 检测参数 = 供给 消耗 残留基质浓度对代谢的影响 限制性基质的概念,发酵过程参数相关分类,理化相关 纯属物质理化性质变化所引起的参数相关 生物相关 生物相关是指通过生物细胞的生命活动所引起的参数之间耦合相关,理化相关,搅拌转速、通气流量、罐压力 溶解氧 DO,转速，气泡，气液接触表面积，KLa，OTROUR，DO,理化相关的普遍特性,理化相关对不同细胞对象具有普遍性，不因细胞生理活性的变化呈现不同的特性。 要注意过程数据采集的非同步性引起的误相关，特别要注意间接参数的变化产生的对过程研究的误导。,生物相关,生物相关是指通过生物细胞的
8、生命活动所引起的参数之间耦合相关，主要体现在二种方式： 其一，通过生物细胞生长代谢后引起的培养液物性的变化，进而引起的参数相关。,菌体生长引起的生物相关特性,快速生长期时，培养液粘度上升，KLa下降，引起DO水平的变化。 培养液粘度的变化也会引起溶解二氧化碳CO2与排气二氧化碳浓度ECO2的差异。 轴向流桨叶所持留的微气泡与快速增长的菌体形成气溶胶现象，结构性粘度严重影响培养液的混和、传递特性。 搅拌转速 ,代谢引起的生物相关,通过生物细胞及代谢途径的不同所引起的活性变化,直接对控制对象特性发生影响。 菌体细胞代谢活性变化而直接引起的某测定参数的变化，即为代谢特性参数相关。 -代谢强度的变化
9、-代谢途径的变化 -引起的基质消耗或代谢产物形成的不同 代谢活性变化：环境条件的线性或动力学因素、细胞内某调节因子引起的代谢流迁移、基因水平的信息流。,生物相关：排气氧浓度与溶解氧浓度的对应关系,不同发酵周期的EO2浓度与DO的几种对应关系。这种不同的对应关系是与不同操作条件和菌体呼吸强度有关的。,rpm,DO,ECO2,EO2,加糖,加糖,ECO2,ECO2,ECO2,EO2,EO2,EO2,DO,DO,DO,rpm,rpm,rpm,h,h,h,h,非碳源限制，临界氧浓度以下（变化不显著）,碳源限制，临界氧浓度以下（变化显著）,非碳源限制，临界氧浓度以上（EO2变化不显著）,碳源限制，临界氧
10、浓度以上（EO2变化显著）,补糖与氮源的利用关系,生物相关：OUR与DO的基本相关特征,OUR,DO,rpm,加糖,DO和OUR之间的动力学特征,O2消耗与过程传递的物质平衡,时间(h),呼吸商(RQ)变化的生物学意义,表征不同的代谢途径 厌氧代谢、耗氧代谢 不同的耗氧代谢途径间的差异 表征不同的基质利用情况 基质还原性强与弱的差异,多基质利用的参数相关变化,某抗生素发酵的糖与油利用转移,不同尺度问题相关的举例,DO,OUR,CLC,Rpm DO 当低于临界氧浓度（)时，下降，细胞代谢由好氧向厌氧途径迁移。,分子水平 基因工程血红蛋白 hemoglobin (VHB) 对氧的亲和力提高（由图所
11、示），临界氧下降。,VHB,第三部分,发酵过程优化控制举例,鸟苷发酵过程优化与多尺度研究,鸟苷是呈味核苷酸二钠“I+G”的重要原料， 七十年代上海工业微生物研究所开始研究 发酵水平：7克/升 12克/升 没有形成产业 广东星湖公司从工微所购买上述菌株，经过多年研究开发： 发酵水平： 12克/升 16克/升,项目背景,项目背景,2000年I+G 产品首次独家面市，遇到日本冲击，同年9月投资2 .1亿的新开发厂区全面停产。 16g/L 25g/L （盈亏持平）,参数相关分析与状态方程建立,通过鸟苷发酵过程的数据采集发现： 40小时OUR下降，补糖速率不变， 鸟苷产率迅速下降代谢流迁移,状态方程建立
12、与系统识别,生物反应器：测量观察值,多尺度：细胞代谢流,代谢途径迁移的酶学测试 HMP途经EMP途经,化学计量学方法的代谢流研究,关键技术,菌体生理形态变异与代谢流迁移的相关性,菌体变异的定量分析与研究,鸟苷生产菌中嘌呤核苷合成途径三段基因序列的分析,嘌呤核苷生物合成与对应的基因操纵子,生产菌的遗传背景研究,对编码肌苷鸟苷生物合成途径中关键酶的基因进行研究： pur操纵子的启动子部分序列（pur操纵子包含嘌呤生物合成途径中有关的12个基因） purA基因（编码AMP支路的sAMP合成酶） guaA基因（编码GMP支路的GMP合成酶） guaB基因（编码GMP支路的IMP脱氢酶） 根据Geneb
13、ank中已公布的枯草杆菌基因组序列，针对所要研究的四段序列，设计适当的引物合成基因。,分别从下列四个菌株中用PCR拉出上述序列：,野生型枯草杆菌（160） 低产型肌苷生产菌7191（161） 目前肌苷生产菌（162） 目前鸟苷生产菌（163）,Genebank,关键技术,研究结果,肌苷和鸟苷生产菌在54位（以翻译起始点为1计）缺失了一个A，因此将导致以下的所有序列发生移码突变，所编码的sAMP合成酶失活，致使AMP合成支路受阻，有利于肌苷和鸟苷的积累。这可能是导致生产菌株产苷水平升高的一个重要原因。,关键技术,结 论,从鸟苷生产菌的基因比较研究结果，本课题的鸟苷生产菌株已具有高产菌的基因结构，
14、而发酵过程中菌体细胞的主流代谢流的迁移是提高生产能力的主要矛盾。,关键技术,跨尺度分析与工艺改进,确定以代谢流由EMP向HMP途径回复迁移为目标进行过程工艺优化，并以OUR的下降作为跨尺度操作的相关因子 发现调控因子A加入后短期内OUR的下降速度就开始放慢，到48小时开始维持稳定直至放罐，并且发酵后期的糖耗速率也变慢,关键技术,关键技术,代谢流控制,工艺改进前后的酶活时序变化,工艺改进前后的代谢流时序变化,结 果,创建了全新的补料控制工艺 50L发酵罐： 17.2克/L 32克/L(60小时) 菌体细胞主流代谢流迁移问题是本项目过程优化的关键。,关键技术,文章、著作发表,发表论文：51篇 出版
15、专著、著作： 多尺度微生物过程优化，化学工业出版社,Study on Industrial Fermentation Process on Multi-scale and Its Optimization , Advance Biochemical Engineering/ Biotechnology , 2003 Volume（87） : Biomanufacturing 2004年3月出版,基因工程人血清白蛋白(rh-SA)趋势曲线图,50L实验室：700mg/L-7g/L，放大到500L,基因工程疟疾疫苗高密度高表达,70mg/L2.6g/L,70mg/L-2.6g/L,华蒙金河生物技术
16、有限公司的生产车间现场（50L放大到120M3），从2000年9月至2001年3月间，饲料金霉素发酵从16000u/ml提高到21000u/ml，新增利润1176万元，新增创汇883万元。,远程通讯与异地数据传送与分析,DO-发酵液中溶解氧浓度、OUR-菌体代谢耗氧速率、CER-二氧化碳释放速率、RQ-呼吸商-代谢途径、KLa-生物反应器中氧传递速率、pH酸碱度、菌体浓度、等40多个参数 9-25小时之间 RQ呈低谷状 必需限制补葡萄糖,推广应用,0-8小时 : OUR、CER、DO、pH、RQ、F 不同水平 8.9小时 : OUR与CER继续上升呈分枝态； pH迅速上升 RQ呈低谷状 非葡萄糖碳源利用； 25小时前: 必需限制补加葡萄糖速率(RGLU),
