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1、病毒与人类健康,动物传染病教研室,总复习,1、1898 伊万诺夫斯基和贝杰林克通过他们创造性工作发现了烟草花叶病毒，从而开创了病毒学独立发展的历程。 2、狂犬病最早记载的动物病毒病 3、1884年 法国 巴斯德Pasteur 狂犬病疫苗 4、病毒学发展经历了4个阶段：经验阶段（病毒的发现）、机体水平研究阶段、细胞水平研究阶段、分子水平研究阶段。,一、病毒的发现与研究历史,二、病毒的分类与命名,（一）动物病毒的命名现状 1、种的命名 1）大多用其所引起疾病的名称，后加“病毒”两字 脊髓灰质炎病毒、猪瘟病毒、流感病毒 2）在病名前加上最初发现该病毒的地名 日本乙型脑炎病毒、东方型马脑炎病毒 3）直
2、接用地名称呼病毒 新城疫病毒（Newcastle disease virus) 4）用人名称呼 马立克氏病病毒(Mareks disease virus),（二）国际上通用的人的流感病毒命名方法 型/分离地点/分离序号/分离时间（年代）（血凝素和神经氨酸酶序号） e.g A/Hongkong/1/68（H3N2） A/京科/1/56（H1N1） H：hemagglutinin 血凝素 N：neuraminidase 神经氨酸酶,三、病毒的分类依据,1病毒的形态学特征 2理化学特性 3核酸的类型、结构及相对分子量 4蛋白质肥大：肥胖星型胶质细胞 5脂质、糖类含量和特性 6在细胞培养中的生长特性
3、7抗原性 8生物学特性,1、不具有细胞结构，也不进行蛋白质、糖类和脂类的代谢活动 2、只具有一种类型的核酸：或DNA或RNA 3、特殊的繁殖方式：复制 4、缺乏完整的酶系统，不具备能量合成系统，也不具有核糖体。 5、绝对的细胞内寄生。 6、某些RNA病毒（反转录病毒）的RNA经反转录合成cDNA，与细胞基因组整合，并随细胞DNA的复制而增殖，即DNA前病毒。,四、病毒的基本特征(病毒与其它生物的本质区别)：,病毒(virus)的定义 病毒是由蛋白质和核酸组成的最小的生命形态，寄生于动物、植物或细菌的细胞中，只能在宿主细胞内才能复制的微生物。,核心（core）：由病毒核酸及其结合蛋白组成，并被壳
4、体包围着的病毒体的中心部分。 核衣壳（nucleocapsid）：病毒核心与衣壳的总称。 囊膜（envelope）: 覆盖在病毒核衣壳外的脂蛋白膜。其组成成分主要来自宿主细胞，是病毒的核衣壳在感染细胞内穿越核膜或在感染细胞表面“出芽”时由细胞膜获得。 纤突（spike）或突起(peplomer）:病毒囊膜表面的糖蛋白突起。,五、病毒体的结构组成,病毒的三种壳体结构 1、二十面体对称（icosahedral symmetry） 2、螺旋对称(helical symmetry) 3、复合对称壳体(complex symmetry),六、病毒体的化学组成,基本化学组成：核酸、蛋白质 其它组成成分：脂
5、类、碳水化合物、聚胺类化合物等 (1)病毒的核酸 同一种病毒碱基组成是恒定的，同科（属）的病毒核酸（）含量相近，不同科属者有所不同，核酸的含量是病毒鉴定的一个指标。 病毒的核酸含量：核酸的分子量占病毒颗粒重量的百分比 病毒核酸的类型：DNA、RNA,（2）病毒蛋白质的功能 构成病毒衣壳和囊膜的重要成分 保护病毒核酸 参与病毒的吸附与侵入过程，决定病毒对宿主和组织的嗜性 构成病毒的表面抗原 构成病毒的血凝素 构成病毒的酶类,七、 理化因子对病毒的作用,物理因子和化学因子 保护作用：有益于病毒的生存 诱变作用：造成病毒某些生物学特性的改变 灭活作用：使病毒活性丧失,（1）温度( “喜冷怕热”) 作
6、用机制：使病毒蛋白质，特别是病毒的表面蛋白质变性。 核酸对热的抵抗力较强。 影响因素：蛋白质、钙、镁、蛋白酶、核酸酶 温度的剧烈变化，尤其是反复冻融常可使许多病毒很快灭活。,1、物理因子,（2）电离辐射 机制：电离辐射中的X射线和射线作用于其它物质后产生次级电子，次级电子再通过直接和间接作用，作用于病毒核酸（DNA或RNA）而使病毒失活。 单链病毒对电离辐射的灭活作用比双链病毒敏感约10倍。,（3）紫外线（主要作用于核酸） 机制： 使嘧啶碱基之间形成二聚体 DNA：TT、CT、CC RNA：UU 核酸链断裂 分子内或分子间交联 核酸和蛋白质之间的交联 核酸不能复制和转录，从而导致病毒的灭活，但
7、病毒蛋白质的免疫原性仍保持。,（4）超声波(20kHz的声波) 主要以强烈振荡作用对病毒、其它微生物以及细胞呈现杀灭或破坏作用。 病毒学中的应用：破碎细胞，释放病毒粒子,2、化学因子,化学灭活剂 化学保护剂,（1）化学灭活剂 酶类 蛋白变性剂 氧化剂 酸、碱 其它化学试剂：福尔马林和亚硝酸等,酶类 核酸酶 破坏核酸 磷脂酶 破坏囊膜磷脂 蛋白酶：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等 pH 大多数病毒 pH 6-8 稳定 pHpH9.0 迅速灭活,脂溶剂 乙醚、氯仿、丙酮：灭活有囊膜病毒 氟里昂、正丁烷：抽提脂质和蛋白质，常用于病毒提纯,机制：与腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶或蛋白质的胺基作用
8、。 病毒的核酸和蛋白质都有破坏作用，但首先是作用于病毒的核酸 用于灭活病毒生产疫苗的甲醛浓度：0.05-0.2%,甲醛和戊二醛,戊二醛 对病毒的作用与甲醛相似，但灭活作用更强，常用于实验室污染器材消毒。,机制：烷化剂上的活性烷基使蛋白质分子上游离的-COOH、-NH2、-SH、-OH和核酸分子中的N发生烷基化作用，使病毒的蛋白质和核酸结构改变，功能丧失，从而被灭活。 种类：环氧乙烷、环氧丙烷、溴化甲烷、丙内酯、乙酰乙烯亚胺等 病毒学中的应用：气体消毒剂 灭活病毒，制备疫苗,烷化剂,石炭酸 阳离子去污剂：SDS、去氧胆酸钠 非离子去污剂：吐温-20、吐温-80、NP-40,蛋白质变性剂,石炭酸
9、剥离病毒粒子的蛋白质衣壳 吐温和去氧胆酸钠 破坏病毒的囊膜，但可保存病毒粒子原来的蛋白结构和抗原性。 SDS 剥离病毒粒子的蛋白质衣壳 使蛋白质降解为多肽 溶解病毒囊膜 NP-40 裂解病毒蛋白质,能够减轻病毒保存过程中其他理化学因子对病毒的损伤，从而保持病毒的感染性、抗原性等生物活性的物质。 甘油： 在50%的甘油盐水，病毒可存活达几十天、几个月至几年（牛瘟病毒例外）。 二甲基亚砜DMSO：减少冷冻过程中微小冰晶的形成,（2）保护剂,八、病毒的保存,病毒的短期保存,直接置-30冰箱中保存 或悬浮于50%甘油盐水中，再置-30冰箱中保存,快速低温冻存 于病毒悬液内加入灭活的动物血清或其他蛋白质
10、保护剂，最好再加一些DMSO（5%-10%），并迅速置-70或-196。 含病毒的组织材料可以直接低温冰冻保存；如先侵入50%甘油生理盐水中，再行低温保存效果更好。,病毒的长期保存,九、 病毒的培养和增殖,1、常规分离与鉴定三大培养方法：动物接种、鸡胚接种、组织培养 2、细胞的种类 传代细胞（异倍体细胞）：由于遗传突变或者在理化学物质和致瘤病毒的作用下，组织培养细胞中出现的恶性病变细胞（癌变细胞）。这种病变细胞具有很高的增殖势能，而且几乎可以无限地传代。,十、病毒的增殖,病毒复制周期:以病毒基因为模板，籍DNA多聚酶或RNA多聚酶等，使细胞转为复制病毒的基因组，转录、翻译出相应的病毒蛋白，最终
11、释放出子代病毒。 病毒复制四个步骤： 吸附和侵入(adsorption and penetration) 脱壳(uncoating) 生物合成(biosynthesis) 组装成熟与释放(assembly and release),干扰素（interferon,IF) 由具有正常生物功能的细胞在适宜诱生剂作用下产生的一组具有多种生物学功能（抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、维持细胞自身稳定）蛋白质。 特点： 干扰素不是细胞持续合成，而是细胞对强烈刺激如病毒感染的应答时一阶段分泌物。 干扰素具有宿主特异性，例如鼠干扰素对人无效，反之亦然。,干扰素抗病毒作用的特点： 干扰素不能杀灭病毒，其抗病毒作用不是直
12、接的，而是一种间接的作用。 干扰素具有广谱的抗病毒活性。 干扰素的抗病毒活性有相对的种属特异性。 不同病毒对干扰素作用的敏感性不同。 机制：A、与细胞表面作用，激活编码抗病毒蛋白质的细胞基因，表达产生能抑制病毒复制的抗病毒蛋白，使细胞建立起抗病毒状态。 B、减轻由于病毒复制所引起的细胞损伤，从而使机体或细胞受到保护。,十一、病毒疫苗的研究进展和发展趋势,疫苗（Vaccine）的概念 一种生物制品，能诱生宿主体内针对某一传染病原的、自然的、保护性的免疫资源从而保护宿主不发生此传染病，同时中断此传染原在宿主群体中的传播（预防性疫苗）。,预防性疫苗直接用于大量健康的人群或动物，尤其用于大量儿童包括新
13、生儿的免疫接种，要求对该类疫苗的设计应着眼于较高的有效性和绝对的安全性。 治疗性疫苗着眼于病患的特殊性，以其致病的关键机理为突破口，靶抗原的选择倾向于功能明确的病原体表位、基序、显现多肽或由此经分子改造和重组的非天然的新型分子等,重组疫苗：通过基因重组技术，将野生毒株的表面抗原基因与弱毒株的其他基因组合构建减毒活疫苗株。适用于分节段基因组病毒，如流感病毒和呼肠孤病毒。 亚单位疫苗：将病毒的保护性抗原基因插入表达质粒，随后转化大肠杆菌或真核细胞等，再收集由其表达和产生的病毒蛋白作为免疫原。,病毒载体疫苗：将保护性抗原基因插入痘病毒、腺病毒和疱疹病毒等DNA的非必需区，构建重组载体疫苗。 基因缺失
14、疫苗：在DNA或cDNA水平上造成病毒毒力有关基因的缺失而构建的疫苗。,转基因植物生产可食（饲）疫苗的优点： 1、生产简单：与动物细胞培养和发酵工程相比，植物种植更易操作，无需复杂的工业化生产设备，而且植物细胞具有全能性，能够再生植株。 2、无其它病原污染: 用动物细胞生产疫苗，霉形体和其它病原的污染极其普遍，这可能对人类和动物造成潜在危险，而转基因植物疫苗则不存在上述问题。 3、使用安全: 免疫原在植物组织中，作为饲料（食品）进入胃肠道，不会引起不良反应。 4、良好的抗原性: 植物细胞具有与动物细胞相似的结构与功能，有利于重组蛋白的正确表达和装配。 5、诱导粘膜免疫反应：口服植物疫苗能诱导机
15、体产生粘膜分泌性IgA。 6、使用方便: 通过直接饲喂（食用）就可达到免疫的目的。,十二、人类的禽流感病毒,流感病毒按抗原结构分H和N两大类，H代表Hemagglutinin（血細胞凝素）,有如病毒的鑰匙，用來打開及入侵人類或牲畜的細胞。N代表Neuramidinase（神經氨酸），是幫助病毒感染其他細菌的因素。 至今由禽鳥傳人的禽流感有三種：甲型H5N1、甲型H7N7及甲型H9N2 流行性感冒病毒依內部核蛋白抗原区分為：、 或型。其中仅型流行性感冒病毒會感染鳥類，属正粘病毒科，流感病毒属。主要有甲(A)、乙(B)、丙(C)型流感病毒。,流感病毒的主要致病因素：血凝素和神经氨酸酶 HA的生物学
16、活性： A、病毒的吸附蛋白 B、具有血细胞凝集活性 C、病毒以膜融合方式进入细胞需要HA的水解 D、是病毒表面的主要抗原，诱生中和抗体和细胞免疫反应，决定病毒的亚型。,神经氨酸酶（NA）糖蛋白作用： A.可水解细胞表面受体特异性糖蛋白末端的N-乙酰基神经氨酸。 B.病毒在细胞表面成熟时，NA可以移去细胞膜出芽点上的神经氨酸，有利于病毒粒子的成熟和释放。 C.具有免疫原性，能诱发相应的抗体,（一）流感病毒的抗原变异,1、抗原漂移(antigenic drift): 亚型中的小变异，形成复杂的准种群(quasispecies) 原因：HA内有4个抗原位点，这些位点中个别氨基酸的改变可引起病毒抗原性的微小改变，即发生抗原漂移。 2、抗原位移(antigenic shift):亚型间的大变异。主要是编码HA或NA的病毒基因发生基因重组或交换,导致HA或NA抗原的突变，由于突变幅度大，导致产生新的亚型。,3、禽流感可以通過多種途徑傳播， 1)消化道 2)呼吸道 3)皮肤損傷 4)眼結膜,4、人类禽流感预防 （1）药物预防： 对密切接触者必要时试用抗流感病毒药物或按中医药辨证施防。 药物预防可用于一岁以上的密切接触者 奥司他韦（Oseltamivir ，达菲） 金刚烷胺和金刚乙胺,
