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1、Western Blot 实验技术及常见问题分析,Western Blot定义Western Blot基本原理、操作流程及注意事项Western Blot常见问题分析,Western Blot定义,主要是利用电泳分离不同的蛋白组分，并将分离所得的蛋白质转移到固相支持体上，通过特异试剂(抗体)作为探针，对靶蛋白分子进行检测的一种方法。,Western Blot基本原理、操作流程及注意事项,蛋白样品的提取及处理SDS-PAGE电泳样品的印记-转膜封闭免疫检测,一、蛋白样品的提取及处理,细胞经预冷的PBS漂洗,收集细胞加入蛋白裂解液，冰上裂解,测定蛋白浓度，加入上样缓冲液,100水浴加热10min,
2、12000g 4离心10min，取出上清液,组织块迅速置于预冷的PBS漂洗,组织称量后加入相应体积的 裂解液进行匀浆 （冰上）,蛋白浓度测定方法,Bicinchoninic acid ( BCA ) 法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合 物稳定性俱佳，且受干扰物质影响小。BCA法的显著 优点是不受去垢剂的影响。,Bradford 法反应迅速，2min即可达到平衡并在1h内保持 稳定。操作简便，只需要一种反应试剂。,SDS,蛋白样品的处理（上样缓冲液）,-巯基乙醇或DTT,溴酚蓝,蔗糖或甘油,样品制备注意事项,制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰。 样品处理中使蛋
3、白质充分变性，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键。 样品建议分装冻存，避免反复冻融。,Western Blot基本原理、操作流程及注意事项,蛋白样品的提取及处理SDS-PAGE电泳样品的印记-转膜封闭免疫检测,二、SDS-PAGE电泳,SDS-PAGE凝胶的制备过程,分离胶的制备,胶上层用水封闭，同时注意气泡,浓缩胶的制备,电泳设备,考马斯亮蓝染胶,SDS-PAGE电泳注意事项,加入试剂后摇匀，防止部分胶块聚合不均匀，摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多氧气。 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀。 加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品，以减少蛋白质带的拖尾现象。 为避免边缘效
4、应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。 低电压短时间的预电泳（恒压10-20V，20-30min），清除凝胶内的杂质。,Western Blot基本原理、操作流程及注意事项,蛋白样品的提取及处理SDS-PAGE电泳样品的印记-转膜封闭免疫检测,三、样品的印记-转膜,半干转移法将凝胶和固相基质象三明治一样夹在用缓冲液湿润滤纸间。 |纸|胶|膜|纸| 槽式湿转法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中。 |海绵|纸|胶|膜|纸|海绵|,转膜过程,膜的选择,硝酸纤维素膜,简单快速,价格便宜,使用前100%甲醇浸泡,价格昂贵,蛋白结合率高,机械强度大,可重复利用,PVDF膜,转膜后检
5、测-丽春红S染色,转膜后用丽 春红S染色， 可见多条粉 红色条带。,转膜注意事项,滤纸、胶、膜之间不能有气泡。 滤纸、胶、膜的大小和摆放顺序。 胶和膜上要做好标记，识别正反面和上下 。 PVDF膜需要100%甲醇预处理，后续操作中膜必须保持湿润。,Western Blot基本原理、操作流程及注意事项,蛋白样品的提取及处理SDS-PAGE电泳样品的印记-转膜封闭免疫检测,四、封 闭,将转印膜浸泡到封闭液中，将膜上没有结合蛋白质的区域结合上蛋白质，目的是使抗体与特异的蛋白质结合。,封闭液5 % TBST脱脂奶粉溶液牛血清白蛋白溶液( BSA ),摇床上缓慢摇动封闭，室温2 h或4过夜。,Weste
6、rn Blot基本原理、操作流程及注意事项,蛋白样品的提取及处理SDS-PAGE电泳样品的印记-转膜封闭免疫检测,五、免疫检测,一抗、二抗孵育,把封闭好的膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入一抗溶液孵育。摇床上缓慢摇动，4过夜。 用洗膜缓冲液漂洗PVDF膜3次，每次10min。 把膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入二抗溶液孵育。摇床上缓慢摇动，室温2h。 用洗膜缓冲液漂洗PVDF膜3次，每次10min。,二抗与底物反应显色,化学发光显色法(ECL ),化学发光法(ECL),ECL显色原理：(二抗用HRP标记)反应物为过氧化物+鲁米诺，如果遇到HRP即发光，可使胶片曝光显影。,DAB显色法,影响抗
7、原抗体反应的因素,电解质-电解质可促进抗原抗体复合物的形成，因此常选用各种缓冲液做为抗体的稀释液。酸碱度-抗原抗体反应需要适宜的pH值环境，一般为pH6.08.0。温 度-温度升高可使反应加速，但温度高于56时，可导致抗原抗体的解离，甚至变性。,Western Blot基本原理、操作流程及注意事项,蛋白样品的提取及处理SDS-PAGE电泳样品的印记-转膜封闭免疫检测,Western Blot常见问题分析,背景太高,抗体浓度过高 封闭不充分 膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 抗体与封闭剂出现交叉反应,原因,对 策,杂交前检测一抗、二抗的工作浓度 延长封闭时间或更换封闭液 转膜前用甲醇将膜完全浸湿
8、 拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液 检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应,非特异条带多,蛋白带型条状,上样过量 样品沉淀 样品中的污染 制胶不佳,原因,对 策,降低上样量 加大样品中的SDS浓度 离心样品 确保灌胶均匀,条带模糊,蛋白样品部分变性 蛋白样品部分还原 电泳时间过长,原因,对 策,完全变性蛋白 确保加入足够的DTT或-巯基乙醇 观察指示剂染料，掌握恰当的电泳时间,哑铃型条带或 “微笑” 条带,上样体积过大导致不完全堆积 电泳过程中电场不均匀 分离胶表面不齐,原因,对 策,使用恰当上样体积 如果蛋白浓度已知，上样时确保对称 制胶时使分离胶表面水平,无条带的原因,蛋白样品制备 检查胶：考马斯亮蓝染胶 检查膜：丽春红S染色 抗体滴度太低 显色 试剂放置太久或存放条件不正确,谢谢,科研交流平台QQ群号：112780353,祝大家实验顺利!,
