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1、第五章 发酵工程的灭菌与空气除菌,设备、基质和空气的净化,第一节 常见灭菌方法,化学、辐射和热灭菌,概述,灭菌的概念： 灭菌 (sterilization)即“失去繁殖能力”的意思，是指采用化学或物理的方法杀灭或去除物料及设备中一切有生命的有机体的过程。 与灭菌相近的几个概念 灭菌与杀菌 (除菌) 杀菌：杀死微生物后，其躯壳仍存在。 溶菌：杀死微生物并使其细胞躯壳溶解、消失。 除菌：从体系中去除微生物细胞。,比较,概述,工业生产中常用的灭菌方法： 化学灭菌 射线灭菌 干热灭菌 湿热灭菌 过滤介质除菌,一、化学灭菌,概念： 化学灭菌指用化学药品直接作用于微生物抑制其增殖或将其杀死的方法。 灭菌剂
2、：迅速杀死体系表面和内部所有微生物。 消毒剂：只杀死体系 (主要是表面)中的病原微生物。 防腐剂：抑制体系 (主要是食品)表面和内部微生物的生长繁殖。 注意：抑菌和杀菌甚至溶菌作用是相对的。,一、化学灭菌,常用的化学药剂 主要有石碳酸、甲醛、氯化汞、碘酒、酒精高锰酸钾等。 共同规律：杀菌强度有别，但在低浓度时都有促进微生物生长的刺激作用，在浓度升高后依次表现出制菌、杀菌和溶菌的现象。 常见化学杀菌剂及其作用机制和应用范围 在发酵工业上的应用 不用于培养基灭菌,一、化学灭菌,环境消毒：生产车间、无菌操作间 器械即手表面消毒：接种器械、取样器械等 使用方法 浸泡、擦拭、添加、喷洒、气态熏蒸等,二、
3、射线灭菌,概念： 射线灭菌是利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的射线进行灭菌的方法。 几种放射性射线 紫外线灭菌 波长为253.7 nm的紫外线杀菌作用最强。 机理：破坏核酸、形成活性自由基。 穿透力差，一般用于环境和物体表面灭菌。 灭菌效果：与距离、时间、微生物等有关。,三、干热灭菌,热灭菌的分类 干热空气灭菌 设备：电热干燥箱 条件：160条件下保温12 h。 注意：灭菌物品用纸包扎或带有棉塞时不能超过170。 使用：玻璃和金属器具。,四、湿热灭菌,湿热灭菌是利用饱和水蒸汽冷凝时释放的大量穿透力极强的潜热使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子受到不可逆破坏的灭菌方法。 条件：121维持2
4、030min。 设备：各种高压蒸汽灭菌器 应用：非常广泛，是发酵工业的主要灭菌手段。,第二节 培养基与发酵设备的灭菌,原理和工艺,一、湿热灭菌的基本原理,微生物的耐热性 温度与微生物生长的关系 微生物热死原因 体内的一些重要蛋白质发生凝固、变性。 致死温度和致死时间 能够杀死微生物细胞的某一最低温度称致死温度。 在致死温度以上的某个温度杀死全部微生物细胞所需的时间称为致死时间。 热灭菌效率的衡量TDP、TDT、D值、z值和F值,一、湿热灭菌的基本原理,微生物的热阻 热阻指在某一特定条件下 (主要是指温度和加热方式等) 微生物细胞的致死时间，表征了不同微生物细胞对热的相对抵抗力。例如一些微生物的
5、相对热阻和抵抗力如表5-1. 微生物热死亡的数学规律 微生物的热死亡规律符合对数规律。 微生物的死亡速率 (dN/dt) 与任何一瞬时残存的活菌数成正比，称之为对数残留定律，用下式表示：,式中： N为培养基中残存的活菌数(个)； t为灭菌时间(s)； k为灭菌反应速度常数或称为菌比死亡速率(s-1),值的大小与灭菌温度和菌种特性有关； dN/dt为活菌数的瞬时变化速率，即死亡速率(个/s)。,(5-1),一、湿热灭菌的基本原理,灭菌时间的确定 将式5-1积分，有：式中：N0为灭菌开始时原有的菌数(个)；Nt为灭菌结束时残留的菌数(个)。,(5-2),一、湿热灭菌的基本原理,影响灭菌时间的因素
6、污染程度 (N0) 灭菌程度或要求 (残留的活菌数Nt) 灭菌反应速度常数 k 实际灭菌要求 Nt常要求1/1000。 热死速率常数 k的判定 可以把微生物热死过程看成一简单一级化学反应,热死速度即反应速度，活菌数即反应物，而热死速率常数即反应速率常数，则由Arrhenius定律有：,式中： A为比例常数，s-1； E为活化能，J/mol； R为气体常数，8.314 J/(molK)； T为绝对温度，K。 k 值与活化能的关系活化能处于指数项，可见其与 k 值的变化关系密切。高温瞬时灭菌 (HTST) 营养损失小的原理，可以从细菌与一些营养物的不同活化能得到解释。,(5-3),一、湿热灭菌的基
7、本原理,k 值与温度的关系式5-3可以变化为：图5-2显示了这种关系。 k 随温度的升高而升高，同一温度下，随微生物种类 (活化能)不同而不同。参见表5-5. 杀灭细菌芽孢时间的估算 与芽孢的种类和培养条件有关。,(5-4),一、湿热灭菌的基本原理,可以根据Q10估算。,表5-6a 估算的芽孢不同温度大概灭菌时间,表5-6b 一些细菌芽孢的实际杀灭时间,二、培养基的灭菌,（一）培养基的灭菌方法 分批灭菌 概念：又称为间歇灭菌，就是将配制好的培养基全部输入到发酵罐内或其它装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备加热 至灭菌温度后维持一定时间，再冷却到接种温度。也称为实罐灭菌或实消。,二、培养基的灭菌,
8、过程：包括升温、保温和冷却等3个阶段。,图5-4 培养基分批灭菌过程中温度变化情况,二、培养基的灭菌,操作步骤 空气过滤器灭菌干燥 打料，开搅拌 开排气阀，开夹套 (蛇管) 预热至8090 同时从卸料管道进气至121 三路进汽，四路出汽保温30min 先后关闭排汽和进汽阀门，同时逐渐通入无菌空气 夹套 (蛇管) 冷却至接种温度,图5-5 分批灭菌的进汽、排汽及冷却水管路系统,1. 空气过滤器灭菌干燥2. 打料，开搅拌3. 开排气阀，开夹套 (蛇管) 预热至80904.同时从卸料管道进气至1215. 三路进汽，四路出汽保温30min6. 先后关闭排汽和进汽阀门，同时逐渐通入无菌空气7. 夹套 (
9、蛇管) 冷却至接种温度,二、培养基的灭菌,分批灭菌的优点： 设备、操作简单，适合小规模发酵 分批灭菌的缺点： 周期长、能耗大，营养成分破坏大 连续灭菌 概念：连续灭菌是将培养基通过专门设计的灭菌器，进行连续流动灭菌后，进入预先灭过菌的发酵罐中的灭菌方式，也称之为连消。 特点：快速，营养成分破坏少 灭菌流程见图5-5.,图5-6 培养基连续灭菌的基本流程,关键点：培养基物料少而分散,二、培养基的灭菌,固体培养基的灭菌 特点：固体培养基一般为粒状、片状或粉状，流动性差，也不易翻动，加热吸水后成团状，热传递性能差，降温慢。 灭菌方法： 自制土蒸锅 转鼓式灭菌器（见下页图）,图5-7 某食用菌工厂的转
10、鼓式灭菌器,二、培养基的灭菌,（二）影响培养基灭菌的因素 培养基成分 培养基中的油脂、糖类和蛋白质会增加微生物的耐热性。 培养基中高浓度的盐类等会减弱微生物细胞的耐热性。 例如：对大肠杆菌，,二、培养基的灭菌,培养基成分的颗粒度 一般对小于1mm颗粒的培养基，可不必考虑颗粒对灭菌的影响，但对含有大颗粒和粗纤维的基质要考虑其结团的影响。 培养基的pH值 pH值6.0，氢离子易渗入微生物细胞内，从而改变细胞的生理反应促使其死亡。 微生物细胞含水量 水分含量低蛋白不易变性，灭菌效果差。,二、培养基的灭菌,微生物性质与数量 不同微生物种类耐热性有很大差距 生理时期上对数期耐热性较差 微生物数量越多耐热
11、性越强 耐热个体出现机会多 传热和死角 培养基中的天然成分含菌较多 冷空气排除情况 原理：冷空气阻碍蒸汽传热且减小分压,二、培养基的灭菌,灭菌对象体积 不论在实验室还是在生产车间，灭菌体积越大，灭菌时间越长。数十吨的发酵罐每升温降温一次有时需23天时间。 其他 如上磅下磅速度，发酵罐内部构造(实消)，搅拌的力度等都会对培养基灭菌效果产生一定的影响。,二、培养基的灭菌,（三）培养基灭菌时间的计算 分批灭菌 简化：不计升温与降温阶段所杀灭的菌数，实际时间较计算值略短。可以由式(5-2)求得。例5-1 某发酵罐内装培养基40m3，在121下进行分批灭菌。设每毫升培养基中含耐热芽孢杆菌为2105个，1
12、21时的灭菌速度常数,(5-2),二、培养基的灭菌,为1.8 min-1。求理论灭菌时间（即灭菌失败机率为0.001时所需要的灭菌时间）。 解：N0=401062105=81012个Nt=0.001个 k= 1.8 min-1 灭菌时间： 若考虑升温阶段(一般100以上)的杀菌贡献，则关键是估算出在这一阶段的平均热死速率常数km，就可根据这段时间tp计算出实际初始菌,二、培养基的灭菌,量Np，进而求出实际所需保温时间t。在这里由于现在普遍采用迅速降温的措施，时间短，所以在计算时一般不考虑降温的杀菌贡献。 若以芽孢为标准，则在计算热死速率常数k的式(5-4)中一般系数A可取1.341036s-1
13、，E可以取2.844105 J/mol，则该式化为式 (5-5)。,(5-4),(5-5),二、培养基的灭菌,利用式 (5-5)可求得不同灭菌温度下的速度常数，再以图解积分法求出温度效应总和，即可求出km：则升温阶段结束时，培养基中残留菌数Np可从下式求得：,(5-6),(5-7),二、培养基的灭菌,则保温所需时间为：利用式 (5-8)就可以计算考虑升温阶段的情况下的实际保温时间。 例5-2 在例5-1中，灭菌过程的升温阶段，培养基从100上升至121，共需15min，若升温阶段按3的梯度近似计算，求升温阶段结束时,培养基中的芽孢数和保温所需的时间。,(5-8),二、培养基的灭菌,解：T1=3
14、73K T2=394K由式 (5-5)可以分别求得各个温度梯度下的热死速率常数：再由图解积分法 (梯形法)求得升温阶段总效应：=(k1T+k2T+k7T)+ (k2T+k3T+k8T)/20.127 K/s,二、培养基的灭菌,则升温阶段平均热死速率常数km为：则升温阶段结束芽孢数Np为：则保温时间t为：,(s-1),(个),二、培养基的灭菌,由此可见，考虑升温阶段的灭菌作用后，保温时间比不考虑的减少了14.9%。所以发酵罐体积越大，其分批灭菌的升温时间越长，升温阶段的对灭菌的贡献就越大，相应的保温时间就越短。,(min),二、培养基的灭菌,连续灭菌 连续灭菌的理论灭菌时间的计算仍可采用对数残留
15、定律，如果忽略升温的灭菌作用，则灭菌保温的时间：式中： C0 为单位体积培养基灭菌前的含菌数，个/mL； Ct 为单位体积培养基灭菌后的含菌数，个/mL。,(5-9),二、培养基的灭菌,例5-3 若将例5-1中的培养基采用连续灭菌，灭菌温度为131，此温度下灭菌速度常数为15min-1，求灭菌所需的维持时间。 解：C0= 2105 个/mLCt= 1 /4106103= 2.510-11 个/mL 所以维持时间t为：可见时间大大缩短(由于反混，实际时间略长)。,(min),三、发酵设备的灭菌,进行气密性检查后，发酵前需要对发酵罐及其附属设备、管线进行灭菌，即“空消”。 发酵罐：0.1 MPa
16、30 min 空气过滤器：0.15 MPa 2 h 补料罐：根据培养基情况 接种管线：0.4 MPa 1 h 消泡剂、酸、碱、电极、取样等其他管线：0.1 MPa 30 min,本节结束,谢谢,灭菌,Sterilization,彻底杀灭或去除,消毒,Disinfection,杀死病原菌,防腐,Antisepsis,食品,化疗,Chemotherapy,宿主体内,杀死 / 抑制,病原菌 / 所有微生物,具体因素,抑制,杀灭或抑制,与灭菌相关的几个概念,图5-1 制菌、杀菌和溶菌的比较,表5-2 常见化学杀菌剂及其作用机制和应用范围,放射性射线,射线：由放射性同位素如60Co或137Cs产生。是一种高能电磁波，波长很短(0.001-0.0001nm)，穿透力强，射程远，危险性大，必须屏蔽(几个cm的铅板或几米厚的混凝土墙)。 X射线：由x光机产生的高能电磁波。波长比射线长，一般小于10埃，射程略近，穿透力不及射线。有危险，应屏蔽(几毫米铅板)。 射线：由放射性同位素(如32P、35S等)衰变时放出来带负电荷的粒子。在空气中射程短，穿透力弱。在生物体内的电离作用较射线、x射线强。,
