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1、第九章 变性和复性,内容简介,包涵体的形成及对生物产品的影响包涵体的溶解（蛋白质变性）蛋白质复性的方法,第一节 包涵体的形成,包涵体,目前用基因工程表达的蛋白质有4000多种，用E.coli表达的占90%以上，在E.coli细胞质内高水平表达的外源蛋白质，尤其是来自真核生物的蛋白质，会形成不溶性聚合物-包涵体。E.coli包涵体,包涵体,包涵体形成原因： 使用高剂量基因和强启动子； 大肠杆菌细胞质环境条件，如pH、离子强度、高还原电位，不同于外源蛋白质正确折叠为最终构象的条件； 缺少蛋白质正确折叠的辅助因子。如催化构象互变的折叠酶，脯氨酰基顺/反异构酶，二硫键异构酶，及增强折叠或阻止聚集的分子
2、伴侣等。 超表达产生的高浓度新生蛋白质由于多肽链不完全折叠，有利于分子疏水序列之间的相互作用，最终导致这些蛋白质的聚集和错误折叠。,多肽链向蛋白质的转变,过快的蛋白翻译使没有充分的时间和空间进行蛋白向高级结构折叠形成热力学最稳定构象,包涵体对分离纯化的影响,有利方面： 蛋白质表达量高； 抗剪切和较高温度，对破碎细胞的方法和条件要求低； 包涵体密度大，易分离； 包涵体的蛋白质纯度较高； 后续蛋白质分离纯化较容易。 不利方面： 需变性复性； 活性蛋白质收率低。,第二节 包涵体的溶解,包涵体的分离,破碎细胞，可耐受较高温度和破碎条件； 离心沉淀包涵体，离心力较低，除去碎片； 洗涤包涵体，包涵体的目的
3、蛋白质含量为80% 左右，含有酯类，蛋白，可用含低浓度的变性剂，如尿素、盐酸胍、Triton X-100，脱氧胆酸钠的缓冲液反复洗涤，黏度高时可用DNAse（除去核酸）、溶菌酶处理（除去肽聚糖），甚至于可用稀NaOH溶液洗涤（脂类皂化），获得较纯的包涵体。,包涵体的分离,1.用表面活性剂和NaCl 混合物洗两次 3.标准蛋白质 5.表面活性剂洗两次 6.细胞破碎物,包涵体的溶解,包涵体的溶解需要打断蛋白质分子内和分子间的共价键（二硫键）、离子键、疏水作用及静电作用等，使多肽链伸展。因此，包涵体的溶解需要强的变性剂，如尿素、盐酸胍或硫氰酸盐，或表面活性剂，如SDS、十六烷基三甲基铵氯化物、肌氨酸
4、、正十二烷基肌氨酸钠等；对于含半胱氨酸的蛋白质，还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT)、二硫基赤藓糖醇、半胱氨酸、谷胱甘肽等使S- S键断裂。,包涵体的溶解,由于金属离子具有催化氧化作用，需要除去。需加金属离子螯合剂，如EDTA、EGTA。温度一般2530，以促进溶解。也有用70%甲酸溶解包涵体。在细胞周质内形成的包涵体，可采用原位溶解法。即在发酵结束时向培养基中加入变性剂和还原剂，在碱性条件下进行包涵体原位溶解（增加细胞膜的通透性，使包涵体溶解出来），无需采用其它破碎细胞方法，再采用双水相萃取除去细胞碎片，获得包涵体溶解液。,第三节 蛋白质复性的方法,蛋白质的复性,在复性过程中，
5、处于伸展状态的肽链，因暴露在外面的疏水侧链基团之间的相互作用而使这些分子很容易发生聚集反应，形成沉淀，这是大多数蛋白质复性率低的一个主要原因。好的复性方法应能够最大程度的抑制蛋白质的聚集反应，促进蛋白质向折叠成正确的空间结构方向反应。探索高效、方便的蛋白质复性方法对于基因工程产品和理论研究均有重要意义。实践证明，由于蛋白质自身的复杂性和多样性，没有那一种复性方法适用于所有的蛋白质。,蛋白质的复性,一个有效、理想的折叠复性方法应具备以下特点： 活性蛋白质回收率高； 正确复性产物易于与错误折叠蛋白质分离； 折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品； 折叠复性方法易放大； 复性过程耗时少。就工业应用，要
6、求折叠复性过程要快速、低成本、高效。虽然蛋白质折叠复性方法很多，但就某种蛋白质仍需通过实验确定最佳方法和条件。,蛋白质的复性,目前发展的复性方法： 稀释复性 透析、透滤复性 分子伴侣指导复性 色谱法复性：凝胶过滤色谱复性、离子交换色谱复性 、疏水色谱复性、亲合色谱复性 反胶团复性 双水相复性,3.1 稀释复性法,这是目前最简单的蛋白质复性方法。将少量的变性蛋白质溶液以一定比例滴加到复性缓冲液中，达到降低变性剂浓度的目的，使处于变性伸展状态的蛋白质分子在溶液中自发地折叠成天然的活性结构。为获得好的复性结果，必须进行复性条件优化。因复性原理不清楚，只能通过实验来确定。一般可采用正交法。影响复性的条
7、件主要有：变性蛋白质溶液组成及浓度、复性缓冲液的组成（离子种类、氧化还原试剂、螯合剂）、离子强度、pH、氧化还原电位、复性温度、稀释倍数、混合方式速度等。,稀释复性法,不同蛋白质因其结构和变性条件及程度的差异，复性条件和影响因素不同，结果也不同。研究控制复性条件和因素的目的是最大限度抑制聚集反应，促进正确折叠反应，达到最大的复性率。伸展蛋白质分子的聚集反应是两个分子或多个分子之间的反应，在动力学上属于二级以上的反应，而正确折叠反应是单个蛋白质分子的自我组装过程，动力学多属于一级反应。两者相比，聚集反应与蛋白质浓度的关系更大。在低浓度进行复性有利于控制聚集反应。,稀释复性法,通常，复性的蛋白质浓
8、度为1050g/mL。存在蛋白质浓度低复性率高，蛋白质浓度高复性率低的矛盾。操作方式一次性稀释：操作方式，速度分段稀释：一般采用两步法，先将变性剂浓 度降低到一中间浓度，最后再完全除去。连续稀释：变性蛋白质溶液与复性溶液按一定 比例连续混合，复性。分段和连续稀释法的复性回收率高于一次性稀释。,蛋白质复性时聚集反应的抑制,复性中最重要的是抑制复性过程的聚集反应。 最常用的是使用聚集反应的抑制剂，其原理为： 稳定正确折叠蛋白质的天然结构， 降低错误折叠蛋白质的稳定性， 增加折叠复性中间体的溶解度， 增加非折叠蛋白质的溶解度， 减少复性中间体接触发生聚集反应。,蛋白质复性时聚集反应的抑制,聚集反应抑
9、制剂的种类： 可促进蛋白质折叠的小分子添加剂，如盐酸胍或尿素，以及一些离液化合物，如烷基尿素、碳酸酰胺类化合物等。在非变性浓度下，是很有效的促进剂。对于某些需要辅因子才表现活性的蛋白质，辅因子、配基、或底物具有很好促进折叠的作用。Zn2+ 和Cu2+可稳定折叠中间体。浓度为0.51.0mol/L的L-精氨酸可大幅度提高折叠效率（使不正确折叠和二硫键不稳定）。,蛋白质复性时聚集反应的抑制,PEG促进折叠复性，PEG与复性中间体特异形成非聚集的复合物，阻止复性时疏水中间体的聚集，复合物折叠形成第二个中间体，并不再与PEG结合。天然蛋白质即由第二个中间体形成。在有PEG存在下的所有的折叠反应具有相同
10、的速率，复性率与PEG的分子量及浓度相关。认为PEG的作用与分子伴侣的作用机理相似。,蛋白质复性时聚集反应的抑制,非离子型表面活性剂，尤其是离子型或两性离子表面活性剂。如 Chaps、Triton X-100、磷脂、十二烷基麦芽糖苷、磺酸甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用。（成胶束，分散蛋白单体作用）使用它们的不利是与蛋白质形成胶团，难以去除，影响后续的分离纯化。 多离子化合物，如肝素，可促进蛋白质的折叠复性，且有稳定蛋白质天然构型的作用。,蛋白质复性时聚集反应的抑制,短链醇类、高渗物，如乙醇、甘油等对蛋白质有稳定作用，可有效降低低聚体的形成。如胰岛素生长因子I的复性，除了在复性液中加入Cu2+和
11、Mg2+、2mol尿素、盐类（1mol/L NaCl、DTT）外，还加入乙醇、甘油等。 单克隆抗体，待折叠复性的蛋白质的抗体可有效的协助其复性，但只有该蛋白质的特异抗体有效。它可与待折叠复性的蛋白质的远离活性中心的疏水区域结合，有效阻止无活性聚集体的形成。,蛋白质复性时聚集反应的抑制,分子伴侣和折叠酶，这类蛋白质主要包括硫氧还蛋白、二硫键异构酶(PDI)、肽酰-脯氨酰顺反异构酶(PPI)、分子伴侣、FK506结合蛋白、Cyclophilin等。分子伴侣和折叠酶不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质折叠复性。由于分子伴侣和折叠酶在蛋白质复性后要除去，且这类蛋白质又
12、十分昂贵，须采用可回收的方法，如固定化方法。 人工伴侣，将变性蛋白质首先加到含表面活性剂的溶液中，以防聚集，然后用环糊精除去表面活性剂，促进折叠复性。这称为人工伴侣复性。,蛋白质复性时聚集反应的抑制,常用的蛋白质复性添加剂 复性添加剂 复性蛋白质 溶液增熵试剂 GdmCl 荧光假单孢菌脂肪酶，溶菌酶，碳酸酐酶II，干扰素- -多肽 尿素 猪生长激素，溶菌酶，IGF-1，干扰素- 多肽 L-精氨酸 荧光假单孢菌脂肪酶，鸡卵清溶菌酶，-糖苷酶 盐类 (NH4)2SO4 溶菌酶 糖类 甘油荧光假单孢菌脂肪酶，溶菌酶，IGF-1 蔗糖 IGF-1 葡萄糖 溶菌酶 N-乙酰基葡糖胺 溶菌酶 肌氨酸 溶菌
13、酶,蛋白质复性时聚集反应的抑制,表面活性剂类 Chaps TGF-类蛋白质，碳酸酐酶II Tween 人生长激素 SDS 干扰素-多肽 月桂酰基肌氨酸钠 单链Fv片段 十二烷基麦芽糖 MHC Triton X-100 碳酸酐酶II PEG 碳酸酐酶II 十八烯甘油 碳酸酐酶II 单十二酰基磷酸酯 溶菌酶 硫代甜菜碱 鸡卵清溶菌酶 短链醇 正戊醇，正己醇， 碳酸酐酶 环己醇,蛋白质复性时聚集反应的抑制,分子内没有S-S键的蛋白质复性相对比较简单，只需抑制聚集反应，不涉及S-S键的形成。S-S键的形成需要适当的氧化还原条件，对于稀释复性法，最简单的方法是通入空气，进行氧化形成S-S键，但氧化速度太
14、慢；最常采用的是适当比例的氧化还原对，如GSH/GSSG,形成S-S键，或使错误S-S键重排，促进正确S-S键的形成。,蛋白质复性时聚集反应的抑制,影响二硫键重排和组建的因素如果复性蛋白质含有二硫键，在复性缓冲液中需加入还原型及氧化型低分子量的巯基试剂的混合物，如谷胱甘肽、半胱氨酸、巯基苏糖醇等，其还原型(13mmol/L)与氧化型的摩尔比为1:1到10:1。这样的氧化还原系统实际上给蛋白质形成一个还原环境，形成游离的巯基，实际上形成正确的S-S键在此环境中也可能被还原。因此，还需在后续步骤加入强的氧化步骤，即加入过量的氧化型巯基试剂，或采用Cu2+诱导的空气氧化，以保证形成正确稳定的S-S键。,二硫键重排和组建,在有氧化还原对存在下，复性缓冲液的pH也很重要，形成S-S键的氧化反应，需要碱性条件下进行。,3.2 透析复性法,透析法也是最传统、应用最普遍的蛋白质折叠复性方法。包括借助超滤实现复性的透滤复性法。由于变性剂均为小分子物质，在透析或超滤时可逐渐透过多孔膜，使变性蛋白质溶液的变性剂浓度逐渐降低，最后除去变性剂，达到使变性蛋白质折叠复性的目的。影响透析和透滤复性的因素与稀释复性复性基本相同。但过程缓慢，耗时间长，效率低。对某些蛋白质复性率高于稀释复性法。,
