细胞死亡与细胞衰老

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1、本章主要内容,细胞凋亡(Apoptosis)细胞衰老 (cellular aging）,就单细胞生物而言，细胞死亡即个体的死亡。 对于多细胞生物，细胞死亡是维持生物体的正常生长发育及生命活动的必要条件。 细胞死亡方式包括：细胞凋亡、坏死、自噬性细胞死亡。它们具有不同形态和分子特征，发挥不同的功能，但均受到细胞内在基因控制。,第一节 细胞死亡,第一节 细胞死亡,程序性细胞死亡（programmed death,PCD）：细胞死亡受细胞内由遗传机制决定的“死亡程序”控制，要求特定的基因表达，是“主动”而非“被动”的过程。 死亡方式主要包括3种：凋亡、坏死、由细胞自噬导致的自噬性细胞死亡。,一、 细

2、 胞 凋 亡,细胞凋亡概念 细胞凋亡特征 细胞凋亡检测 凋亡的生理学及医学意义 凋亡的分子机制,细胞凋亡(apoptosis) ：一种有序的或程序性的细胞死亡方式，是细胞接受某些特定信号刺激后进行的正常生理应答反应。该过程具有典型的形态学和生化特征，凋亡细胞最后以凋亡小体被吞噬消化。 Apoptosis的概念源自于希腊语，原意是指树叶或花的自然凋落。细胞发生程序性死亡时，就像树叶或花的自然凋落一样，凋亡的细胞散在于正常组织细胞中，被巨噬细胞吞噬，无炎症反应，不遗留疤痕。,细胞凋亡的概念,（一） 细胞凋亡的特征,形态特征质膜内折；染色质固缩；有凋亡小体,（一）细胞凋亡的特征,凋亡的起始：细胞表面

3、的特化结构消失，细胞膜依然完整；线粒体大体完整，核糖体逐渐与内质网脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，沿着核膜分布。凋亡小体的形成：染色质断裂，与某些细胞器等聚集在一起，被反折细胞质膜包裹，形成球形的结构，称为凋亡小体。 凋亡小体为邻近细胞或吞噬细胞所吞噬，在溶酶体内被消化分解。,细胞凋亡的过程及特征,（一）细胞凋亡的特征,（二）细胞凋亡的检测方法,形态学观察：化学染色法（台盼蓝）和荧光染色（DAPI染细胞核）、吉姆萨染色法（染色质着色） DNA电泳：呈现出梯状条带（DNA ladders） DNA断裂的原位末断标记：凋亡细胞的核DNA断裂后产生3-OH末端，用荧光素对凋亡细胞

4、核或凋亡小体进行原位染色。,a 正常T细胞杂交瘤细胞 b 凋亡细胞(扫描电镜) c 凋亡细胞(透射电镜),（二） 细胞凋亡的检测方法,DNA在核小体间断裂形成180200bp的片段，琼脂电泳出现梯状条带。,细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1细胞色素c诱导0 h 2细胞色素c诱导1 h 3细胞色素c诱导2 h 4细胞色素c诱导3 h 5细胞色素c诱导4 h 6阴性对照 7Marker,凋亡细胞的DNA电泳,彗星电泳法：凋亡细胞中DNA降解片段泳动速度较快，使细胞核呈现彗星式图案。 流式细胞分析：凋亡的亚二倍体细胞。 检测细胞膜成分变化：磷脂酰丝氨酸翻转至细胞膜外侧。,（二）细胞凋亡的检测方法

5、,生物发育过程中的需要 参与免疫耐受的形成：对识别自身抗原的T细胞克隆进行选择性地消除。 生理性保护机制，清除体内多余、受损或危险的细胞而不对周围的细胞或组织产生伤害。 维持机体细胞总数的平衡和机体的生命活力。 人体细胞凋亡的失调，引发多种疾病。凋亡不足引发肿瘤和自身免疫病；过度凋亡导致免疫功能的丧失或引发炎症。,（三）细胞凋亡的生理学及医学意义,蝌蚪在向成体变态发育过程中尾的消失,脊椎动物的神经系统发育,细胞凋亡使神经细胞与靶细胞的数量相匹配,发育过程中手和足的成形过程,（四）细胞凋亡的分子机制, caspase家族 caspase切割底物 外界信号与凋亡 线粒体与凋亡,诱导细胞凋亡的因子,

6、物理性因子: 包括射线（紫外线， 射线等）；较温和的温度刺激（如热激，冷激）等。 化学及生物因子：包括活性氧基团和分子（超氧自由基，）；DNA和蛋白质合成的抑制剂；正常生理因子（激素，细胞生长因子等）失调；凋亡因子如肿瘤坏死因子（TNF）处理等。,1、caspase家族,线虫Caenorhabditis elegans是研究个体发育和细胞程序性死亡的理想材料（生命周期短，细胞数量少）。 线虫神经系统由302个细胞组成。这些细胞来自于407个前体细胞。也就是说105个细胞发生了程序性死亡。, caspase的发现, caspase的发现,控制线虫细胞凋亡的基因主要有3个： Ced-3、Ced-4

7、和Ced-9 Ced-3和 Ced-4的作用是诱发凋亡； Ced-9 阻止Ced-3、Ced-4激活，抑制细胞凋亡。 Ced3哺乳类同源物是白介素转换酶 (Interleukin-1-converting enzyme，ICE)，即caspase1。,caspase家族,哺乳动物细胞中发现15种caspase蛋白。根据在细胞凋亡过程中发挥的功能不同，可分为两类： 凋亡起始者（起始caspases ）：2、8、9、10、11参与凋亡启动，负责对效应者的前体切割，产生有活性的效应者。 凋亡执行者（效应caspases ）： 3、6、7执行细胞凋亡，负责切割细胞核内、细胞质中结构蛋白和调节蛋白，使其

8、失活或活化，保证凋亡程序的正常进行。,caspase是天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶的简称。 caspase活性位点是半胱氨酸， 切割位点是靶蛋白天冬氨酸残基后的肽键。,caspase家族,2、 caspases依赖性细胞凋亡途径,由死亡受体起始的外源途径 由线粒体起始的内源途径,（1）死亡受体介导的细胞凋亡, 当细胞接受凋亡信号分子(Fas,TNF等)后，凋亡细胞表面信号分子受体相互聚集并与细胞内的衔接蛋白结合。 衔接蛋白募集caspases2、8和10聚集在受体部位。 caspase相互活化并产生级联反应，使细胞凋亡。,细胞凋亡过程中caspases级联效应,胞外信号诱导细胞凋亡,2、

9、8和10,凋亡起始, 下游caspases活化后，作用于底物。 裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体； 裂解DNase结合蛋白，使DNase释放，降解DNA形成DNA Ladder； 裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬； 导致膜脂重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。,（1）死亡受体介导的细胞凋亡,fas,fas又称作APO-1，属TNF受体和NGF受体家族。 1993年人白细胞分型国际会议统一命名为CD95。 fas基因编码产物为分子量45KD的跨膜蛋白。 Fas蛋白与Fas配体组成Fas系统，二者的结合导致靶细胞走向凋亡。,Fas诱导的细胞凋亡,Fas与配

10、体（如TNF）结合发生三聚化，使胞内的DD区（Death domain）与接头蛋白FADD的DD区结合。 FADD N端通过DED区（death effector domain）与Caspase-8前体蛋白和CAP3结合，激活caspase-8 。,caspase-8酶原自剪切活化，切割效应caspase（ caspase -3 酶原），产生有活性的caspase -3，导致细胞凋亡。 caspase可降解结构蛋白、信号蛋白、转录调控蛋白、周期蛋白等等。 活化的caspase-8还通过切割信号分子Bid，将凋亡信号传递到线粒体，引发凋亡的内源途径，使凋亡信号进一步扩大。,（2）细胞凋亡的内源途

11、径,当caspase8活化后，其中一个途径被运送到线粒体，导致细胞色素C释放。CytC与胞质中Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子)结合诱导细胞凋亡Apaf-1：线虫Ced4在哺乳动物细胞中的同源蛋白，通过N端CARD结构域（caspases募集结构域）招募细胞质中的caspase9酶原。caspase9酶原在凋亡复合体中发生自身切割而活化。活化的caspase9切割并激活caspase3、7，引发细胞凋亡。,细胞凋亡信号途径,线粒体向细胞质内释放多个凋亡相关因子，诱发caspases非依赖性的细胞凋亡。 凋亡诱导因子（AIF）：从线粒体释放到细胞质基质中，进而进入细胞核，引起核内DNA凝集并断裂

12、。 限制性内切核酸酶G（endonuclease G）:负责线粒体DNA的修复和复制。受到凋亡信号的刺激，endo G从线粒体释放，进入细胞核，对核DNA进行切割。,3、 caspases非依赖性的细胞凋亡,2002年10月7日英国人悉尼布雷诺尔、美国人罗伯特霍维茨和英国人约翰苏尔斯顿，因在细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔诺贝尔生理与医学奖。,Sydney Brenner,H. Robert Horvitz,John E. Sulston,二、细胞坏死,细胞坏死 是细胞受到急性强力伤害时立即出现的反应。 早期表现为细胞膜破坏，线粒体肿胀。 继而溶酶体破裂,细胞内容物流出, 引起炎症。,细胞凋亡

13、与细胞坏死比较,Kerr（ 1972）最先提出，与细胞坏死的区别是： 细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体； 凋亡小体内有结构完整的细胞器； 不引起炎症； 线粒体无变化，溶酶体活性不增加； 内切酶活化，DNA有控降解，凝胶电泳图谱呈梯状； 凋亡通常是生理性变化，而细胞坏死是病理性变化。,坏死细胞,凋亡细胞,细胞坏死,细胞坏死时，细胞质膜发生渗漏。 细胞内容物，包括膨大和破碎的细胞器以及染色质片段，释放到胞外，导致炎症反应。 染色质不发生凝集，也不产生有规律的200bp的DNA降解片段，而是被随机降解，电泳时产生“拖尾”现象。,细胞坏死的作用,细胞坏死可能在细胞的免疫反应中发挥重要作用。 细胞感染

14、病原体后，可能通过“自杀”方式消灭病原体，可以作为凋亡的“替补”。 被感染的细胞坏死后，胞内的病原体信号分子如病毒核酸等被释放，能够被免疫细胞识别，促发固有免疫反应。,三、自噬性细胞死亡,细胞自噬：细胞通过溶酶体与双层膜包裹的细胞自身物质融合，从而降解细胞自身物质的过程。 寿命较短的蛋白质通过泛素-蛋白酶体系统进行降解；寿命较长的蛋白质及细胞结构通过细胞自噬途径，由溶酶体进行降解。,细胞自噬过程 膜泡的形成、扩展 自噬体的形成 自噬体与溶酶体融合后形成自噬溶酶体 内含物被溶酶体中的水解酶消化,三、自噬性细胞死亡,细胞自噬的特征及过程,第二节 细 胞 衰 老,衰老的概念Hayflick界限衰老特

15、征衰老的分子理论,（一）衰老的概念,细胞衰老(cell aging ，cell senescence)：一般指复制衰老，即体外培养的正常细胞经过有限次数的分裂后，停止生长，细胞形态和生理代谢活动发生显著改变的现象。 培养细胞的衰老，机体内细胞的衰老,（二） Hayflick界限, 1961年，Hayflick 首次报道了体外培养的人成纤维细胞具有增殖分裂的极限。 Hayflick界限：细胞，至少是培养的细胞，不是不死，是有一定寿命的；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，平均传代4060次，此后细胞逐渐解体死亡。,（二） Hayflick界限,癌细胞或培养的细胞系是不正常细胞，其染色体

16、数目或形态已经不同于原先的细胞 细胞的增殖能力与供体年龄有关 物种寿命与培养细胞寿命之间存在着一定的关系,不同年龄来源的人成纤维细胞的增殖代数,物种的寿命与体外培养时细胞传代次数的关系,三、衰老细胞结构的变化,细胞核的变化 内质网的变化: 衰老动物内质网弥散性分散于核 周胞质中，肿胀，糙面内质网总量似乎是减少了，蛋白质合成量减少。 线粒体的变化: 通常，细胞中线粒体的数量随龄减少， 而其体积则随龄增大。 致密体的生成：由溶酶体或线粒体转化而来。 膜系统的变化,细胞核的变化,体外培养的二倍体细胞，细胞核随着细胞分裂次数的增加不断增大。细胞核的核膜内折，染色质固缩化。,膜系统的变化,衰老的细胞，其膜流动性降低、韧性减小。衰老细胞间，间隙连接减少;细胞膜内（P面）颗粒的分布也发生变化,