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1、第四章 PCR引物设计及测序结果分析,Content,聚合酶链式反应（PCR） 的技术原理及结果分析 PCR引物设计原理及相关软件的使用（ Primer Premier 5.0 ） 测序结果分析,一 . PCR的技术原理及结果分析,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。PCR不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。,PCR技术原理,以拟扩增的DNA分
2、子为模板，以一对分别与模板5末端和3末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。,正义链,反义链,基本分子生物学研究手段,PCR,PCR反应液体的成分:PCR循环的程序:PCR原理：,基本分子生物学研究手段,RT-PCR反转录PCR,mRNA-cDNA-PCR,基本分子生物学研究手段,Cutting by enzymes,基本分子生物学研究手段,Southern Blot,基本分子生物学研究手段,Northern Blot,PCR技术的基本过程,模板DNA dNTP 引物 Buffe
3、r,预变性,模板DNA dNTP 引物 Buffer,TaqDNA聚合酶,循环仪,94oC 5,94 55 72 ,模板与引物的复性,引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。 Tm,在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA 94C,从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，按53的方向沿着模板顺序合成新的DNA链 72C,变性,退火,延伸,PCR出现的问题：PCR扩增未得到目的条带？扩增出目的条带之外的多条带（非特异性）？扩增的目的条带很弱？,引物是否合适?,引物设计是PCR 技术中至关重要的一环,PCR结果分析,PCR结果。12、PCR产物（3ul样品）,PCR常见问题
4、,1. 无扩增产物,模板:含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 退火温度太高,2. 非特异性扩增,引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 退火温度偏低 循环次数过多,3. 拖尾,产物在凝胶上呈Smear状态,M 1 2,模板不纯或降解 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多,4. 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况),交叉污染,对策,操作时防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 除不能耐高温的物质外，所有试剂器材均高压消毒。离心管及枪头等一次性使用。 各种试剂先进行分装，低温贮存。 设置阳性和阴性对照，重复
5、实验,1、目的基因的克隆：PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。2、基因的体外突变：可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。,PCR的应用,3、DNA和RNA的微量分析：PCR技术高度敏感，对模板的含量要求很低，是DNA和NA微量分析的最好方法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。 4、基因转录水平检测RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水平. 5、基因突变分析：利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。,二. PCR引物设计原理及相关软件的
6、使用（ Primer Premier 5.0 ）,引物 引物的重要性 引物设计的原则 引物同源性分析 引物设计软件 如何使用Primer Premier 5.0 酶切位点及保护碱基的添加,引物（primers),引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。(上游引物与DNA序列一致,下游引物要反相互补.),3,3,5,5,Sense primer,Antisense primer,引物的重要性,在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结
7、合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。,引物设计原则,引物长度 碱基分布的均衡性 Tm值 引物二级结构 引物3端 引物5端 引物的内部稳定性 引物的保守性与特异性 扩增区域的二级结构,引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。,基本原则：,引物长度（primer length） 产物长度（product length） 序列Tm 值(melting temperature) 形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex for
8、mation and hairpin）的能值 在错配位点（false priming site）的引发效率 引物及产物的GC含量（composition）,具体因素：,一般原则：,1. 引物的长度：配对引物的长度一般在15-30bp之间比较合适。尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过 5） Tm值的计算：一般的公式：Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 2. 引物的GC%含量：一般为40%-60%。上下游引物的GC含量不能相差太大。,3. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。4. 引物3端的末位碱基避开密码子的第3位，且最好不选择A
9、5. 引物的5端可以修饰，而3端不可修饰。,6. 引物无回文对称结构，否则会形成发夹结构；引物自身不能配对，否则易形成约两个引物长度的引物二聚体；,发夹结构,引物二聚体,7. 引物5端可以有与模板DNA不配对碱基，在5端引入一段非模板依赖性序列。 5端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5端加上适当数量的保护碱基）。 5端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。 5端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。,8. 引物的保守性与特异性,保守性：通用引物检测同一类病原微生物尽可能多的型别 特异性：避免非特异性扩增,引物同源性分析,用Blastn软件进行同源
10、性比较尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作为引物选择3端与非目的基因不同源的序列作为引物,引物设计软件,Primer Premier 5.0 生物软件网下载 安装后，用文本编辑器打开WIN.INI，将vspace=DU改为vspace=PU便可以使用全部功能。 Oligo primer 3 The Primer Generator NetPrimer,如何使用Primer Premier 5.0,引物设计 一般引物设计 5带酶切位点引物设计 巢式PCR引物设计 多重PCR引物设计 探针设计 引物评析,Primer Premier 5.0主要功能: 1、引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、
11、DNA 基元(motif)查找 4、同源性分析,Primer Premier 5.0使用介绍,Preimer Premier 启动界面,Load sequence,http:/,Sequence name,Original sequence,Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DNA seq 8种密码子偏好,Choose a function,引物设计界面,引物设计界面,First you can design the primer manually,Sense
12、 strand or anti-sense strand,Useful information of the primer,引物搜索选项设定,引物类型,搜索模式,5引物位置范围,3引物位置范围,产物大小范围,引物长度,搜索结果,28对引物,引物分值 100分为满分,每对引物的信息,双击选中一对引物,引物信息,回到主窗口,引物及产物信息,是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer,引物编辑,引物编辑,编辑引物,分析引物结果,确认编辑的引物,基因克隆,酶切位点及保护碱基的添加,酶切位点的查找,酶切位点的选择原则:,DNA序列当中不含有该酶切位点. 载体中只在多克隆位点含有该酶切位点.按照酶切位点在多克隆位点中的顺序分别将选用的酶切位点放在上下游引物中.尽量选择粘性末端的酶切位点. 在有多种选择的情况下,选择便宜且酶切效果好的.,http:/,保护碱基 酶切位点 引物序列,三. 测序结果分析,测序结果得送检.测序结果的观察.测序结果得比对.,好的测序结果,不能选用的测序结果,测序结果的比对,Thank You,
