荧光光谱分析仪和原子光谱分析仪

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1、第十七章 荧光光谱分析仪 和原子光谱分析仪,荧光光谱分析仪的原理与结构,荧光光谱分析仪的特点和应用,原子光谱分析仪的原理与结构,原子光谱分析仪的特点和应用,主 要 内 容,学 习 要 求,掌握荧光光谱仪的基本原理和结构。 掌握原子吸收分光光度计和原子发射光谱仪的基本原理和结构。 熟悉荧光光谱仪的使用与维护,原子发射光谱仪的特点。 了解荧光光谱分析法和原子光谱分析法在临床检验中的应用。,光谱分析技术的分类,分子吸收法:紫外-可见分光光度法分子光谱分子发射法: 分子荧光光谱法 光谱技术原子吸收法：原子吸收光谱法原子光谱 原子发射法：原子发射光谱法、原子荧光光谱法,光谱分析技术的分类,根据物质对光谱

2、响应特征的不同分类吸收光谱分析技术：利用物质的特征吸收光谱进行分析光谱技术 发射光谱分析技术：通过测量原子或分子的特征发射光谱来研究物质结构和测定其化学组成 散射光谱分析技术：利用悬浮颗粒混浊液的散射光强度或对入射光减弱的原理进行定量分析,光谱分析技术的分类,X射线吸收光谱法原子吸收光谱法吸收光谱分析技术： 紫外-可见分光光度法（根据吸收光谱所在光谱区不同） 红外吸收光谱法磁共振光谱法X射线光谱法原子发射光谱法 光谱技术 发射光谱分析技术： 原子荧光光谱法（根据光谱区和激发方式不同） 分子荧光光谱法化学发光分析法散射光谱分析技术： 散射比浊法（根据测定仪器和方法的不同） 透射比浊法,第一节 荧

3、光光谱分析仪,荧光：某些物质吸收光能量后，可发射波长与激发光波长相同或不同的光，当激发光源停止照射试样时，再发射过程立即停止，这种再发射的光称为荧光（fluorescence）。荧光包括分子荧光和原子荧光。,一、概 述,荧光产生机制 物质的分子吸收了照射光的能量后，处于基态最低能级的分子被激发到电子激发态的各个振动能级。被激发的分子与周围的分子碰撞，并把部分能量以热能的形式传给周围的分子，自己降落到单线第二电子激发态的最低振动能级。然后，由此最低振动能级向基态的各个振动能级跃迁，同时以发光的形式释放出其能量。这种光即为荧光。,一、概 述,（一）激发光谱和荧光光谱 任何发射荧光的物质都具有两个特

4、征光谱，即激发光谱（excitation spectrum）和荧光光谱(fluorescence spectrum)。 激发光谱和荧光光谱是荧光分析中定性和定量的基础。,二、荧光分析的基本原理,激发光谱：将激发光的光源用单色器分光，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长的激发光照射下，物质溶液发射的荧光强度的变化。 以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，即可得到荧光物质的激发光谱。从激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波长ex。,二、荧光分析的基本原理,荧光光谱：用最强激发波长ex作激发光源，并固定强度，而让物质发射的荧光通过单色器分光，测定不同波长的荧光强度。 以荧光波

5、长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，便得荧光光谱。荧光强度最强时的波长称为最大发射波长em 。 荧光物质的ex和em是鉴定物质的依据，也是定量测定中所选用的最灵敏的波长。,二、荧光分析的基本原理,（二）物质的分子结构和荧光的关系 强荧光物质的分子结构特征：具有大的共轭- 双键结构，共轭体系越大，越容易产生荧光；具有刚性平面结构；具有最低的单线电子激发态，S1为- 型；若取代基团为给电子取代基，荧光强度增加。,二、荧光分析的基本原理,三、荧光光谱仪的原理与分类,荧光分析法：通过测定物质分子产生的荧光强度进行物质的定性与定量分析的方法。 荧光光谱仪：采用荧光分析法来测量的仪器。,三、荧光光谱仪的原理

6、与分类,荧光光谱仪的工作原理在激发光的频率、强度以及液层厚度不变的情况下，荧光物质所发射的荧光强度与溶液的浓度成正比。因此，可以通过测定荧光强度来求出该物质的含量。荧光分析法所测量的是待测物质所发射的荧光强弱，属于发射光谱分析。,三、荧光光谱仪的原理与分类,荧光分析的特点 优点：灵敏度高（可达1012个数量级）；选择性强，有利于分析复杂的多组分混合物；用样量少、特异性好、操作简便。 缺点：对温度、pH值等因素变化比较敏感；应用范围较窄，只能用来测量发荧光的物质，或与某些试剂作用后发荧光的物质。,三、荧光光谱仪的原理与分类,荧光光谱仪分类 荧光光度计（fluorophotometer） 荧光分光

7、光度计（fluorospectrophotometer）二者的区别在于荧光光度计采用滤光片做单色器，结构较简单，功能也较差。而荧光分光光度计采用棱镜或光栅为色散元件，结构较复杂，功能较强，但价格远远高于荧光光度计。,三、荧光光谱分析仪的原理与分类,Fluoscence荧光分光光度计,FP-6500荧光分光光度计,三、荧光光谱仪的原理与分类,三、荧光光谱仪的原理与分类,Jasco荧光光谱仪,三、荧光光谱仪的原理与分类,ARL 9800 系列 X射线荧光光谱仪,荧光光谱仪的主要结构 激发光源：用来激发荧光物质产生荧光，可以用卤钨灯、氙灯、汞灯、氙-汞弧灯、激光器以及闪光灯等，最常用的是氙灯。 单色

8、器：分离出所需要的单色光。荧光光谱仪有两个单色器，一是激发单色器，用于将入射的激发光变成单色光；二是发射单色器，用于将发射的荧光变成单色光。,四、荧光光谱仪的结构,荧光光谱仪的主要结构 样品池：放置测试样品，用石英做成。 检测器：接受光信号并将其转变为电信号。 记录显示系统：检测器出来的电信号经过放大器放大后，由记录仪记录下来，并可数字显示。,四、荧光光谱仪的结构,紫外-可见分光光度计结构示意图,荧光分光光度计光路图,四、荧光光谱仪的结构,荧光光谱仪的性能指标主要包括： 灵敏度 波长范围 波长精度 分辨率 光谱带宽 信噪比,五、荧光光谱仪的性能指标,灵敏度 灵敏度是指能被仪器检出的最低信号，或

9、某一标准荧光物质稀溶液在选定波长的激发光照射下能检出的最低浓度，是仪器最重要的性能指标之一。 多数荧光光谱仪的灵敏度较高，可达10-10g10-12g水平，有利于检测体液中的微量物质。,五、荧光光谱仪的性能指标,波长范围 波长范围指荧光光谱仪的有效工作波段，包括激发通道波长范围、投射通道波长范围和荧光通道波长范围。 波长范围越大，应用范围越广。 一般荧光分光光度计都采用氙灯作光源，光栅为单色器分光元件，其有效工作波段在200nm1000nm范围之内。,五、荧光光谱仪的性能指标,波长精度 指其波长计数器的指示值与真实光波长的数值相符的程度。 特定的激发波长和发射波长是定性分析和定量测定的基础，因

10、此波长精度也是荧光光谱仪的核心指标之一。 目前荧光分光光度计的波长精度误差在（0.2nm2nm）范围之内。,五、荧光光谱仪的性能指标,分辨率 指荧光仪器对靠近的峰尖分开的能力，它与波长精度有密切关系，决定着对混合物成分分析特异性的好坏。 常用仪器的分辨率在0.2nm5nm之间，主要由光栅的每毫米刻线数决定。,五、荧光光谱仪的性能指标,光谱带宽 指仪器主机狭缝宽窄程度的指数。 以一定狭缝几何密度对应的光谱半宽度来直接表示光谱纯度。 光谱纯度直接影响仪器的分辨率、灵敏度以及背景干扰。 目前的荧光分光光度计的光谱带宽在0.15nm20nm之间，一般都采用连续可调方式。,五、荧光光谱仪的性能指标,信噪

11、比与响应速度 用空白样品测得的峰值叫做噪声峰值，待测样品测得的峰值和噪声峰值之比就叫做信噪比。 信噪比越高，检测结果的准确性也越高。 仪器的响应速度是指电路样品通道对光电信号反映的快慢。响应速度关系到波长扫描速度的选择、光谱峰的尖锐程度以及随机噪声的大小。,五、荧光光谱仪的性能指标,荧光光谱仪的使用与维护 严格按照仪器规定的操作步骤进行操作。 电源：电压、电流、电源的稳定须符合仪器规定。光源：需预热20min，灯及其窗口要保持清洁。单色器：应注意防潮、防尘、防污和防机械损伤。光电倍增管：加高压时切不可受外来光线直接照射。样品池：使用时应同一个方向插放，不能经常磨擦。,六、荧光光谱仪的使用与维护

12、,仪器出现故障，必须请专门人员进行检修。 安全防护：操作者不能直视光源，以免紫外线损伤眼睛。,六、荧光光谱仪的使用与维护,荧光光谱仪的故障排除,七、荧光光谱仪的临床应用,荧光光谱仪主要应用于以下方面： 常规分析：用于荧光物质的定性和定量分析、化学表征、色谱流出物的检测等； 获得分子信息：如测量分子内间距、决定键合平衡、研究结构变化等；,医药研究：研究膜结构和功能、确定抗体的形态、研究生物分子的异质性、评价药物的相互作用、确定酶的活性和反应、荧光免疫分析、监测体内化学过程等； 环境监测：水和空气中污染物的鉴别和计量等。,七、荧光光谱仪的临床应用,第二节 原子光谱分析仪,一、概 述,原子光谱分析仪

13、的分类,二、原子吸收光谱仪,原子吸收光谱法 (Atomic Absorption Spectroscopy，AAS)基本原理：从空心阴极灯或光源中发射出一束特定波长的入射光，在原子化器中待测元素的基态原子蒸汽对其产生吸收，根据朗伯-比尔定律，吸光度与待测元素浓度及测量光程成正比关系，通过测量透射光的变化，可求出样本中待测元素的含量。,原子吸收光谱仪（atomic absorption spectrometer） 采用原子吸收光谱法进行测量的仪器，又称原子吸收分光光度仪，是20世纪50年代中期出现并逐渐发展起来的一种新型仪器。 结构原理与普通分光光度计相似，只是用锐线光源代替了连续光源，用原子化

14、器代替通常的吸收池。,二、原子吸收光谱仪,线光谱：由一系列分立的谱线所组成，是气态原子或离子被激发而发射的光谱。 带光谱：由数个分立的谱带组成，每个谱带又由许多密集的谱线所组成。是气态分子被激发而发射的光谱。 连续光谱：由波长连续的光谱组成，没有分立的谱线和谱带。由炽热的固体或液体受激发而发射的光谱。连续光谱和带光谱不能用于发射光谱分析，在发射光谱中只会造成背景，叠加在所要检测的谱线上而干扰测定。,二、原子吸收光谱仪,原子吸收光谱仪工作原理 光源发出与待测元素特征波长相应的射线，把试样的溶液以细粒子流的形式喷射到火焰上，部分射线被吸收。吸收的强度与试样的浓度成正比，通过测量吸收量，即可确定待测

15、物质浓度。 不同元素外层电子结构不同，其原子的吸收光谱也不同，因此测量原子吸收光谱也可以对物质进行定性分析。,二、原子吸收光谱仪,原子吸收光谱仪的种类 单光束型：仪器结构简单，价格便宜，维护方便，应用比较普遍，但不能克服光源灯不稳定带来的零漂 。 双光束型：仪器构造比较复杂，能够克服零漂，而且速度也较快，但价格也较昂贵。,二、原子吸收光谱仪,原子吸收光谱法优点：,灵敏度高、精确高 选择性好、干扰少 速度快，易于实现自动化 可测元素多、范围广 结构简单、成本低,二、原子吸收光谱仪,二、原子吸收光谱仪,（1）光源系统：发射被测元素的特征共振辐射。 基本要求：光谱纯度高，只发射待测元素光谱；发射较窄

16、的谱线；稳定性好，30分钟内漂移不超过1；结构牢固可靠，使用方便；常用类型：空心阴极灯蒸气放电灯无极放电灯,二、原子吸收光谱仪,空心阴极灯是一种低压气体放电管，由一个阳极和呈空心杯形的阴极组成，阳极用钨棒制成，阴极是用被测元素的纯金属或者合金制成。将阴极,二、原子吸收光谱仪,和阳极低压密封于充有惰性气体的玻璃管中。玻璃管中设有石英窗，以便透过紫外线。惰性气体采用氖和氩。当两个电极施加电压时（约500V），电子由阴极高速飞向阳极，并与惰性气体碰撞而电离，电离后产生的正离子在电场的作用下强烈地轰击阴极表面，导致阴极表面的金属原子溅射出来，溅射出来的原子再与电子、惰性气体原子及离子碰撞而被激发，便发射出被测元素的特征光谱。,（2）原子化器：提供能量将液态试样中的待测元素干燥蒸发使之转变成气态的基态原子。原子化器的性能直接影响测定的灵敏度和重现性。原子化过程是整个原子吸收法的关键。,二、原子吸收光谱仪,