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1、第三章 基因克隆的酶学基础,1. 简述,核酸酶： 通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸键发生水解断裂的蛋白酶。分为两类：从核酸分子末端开始，一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链的叫核酸外切酶（exonuclease）;从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫做核酸内切酶（endonuclease） 核糖核酸酶（RNase）：水解断裂RNA分子 脱氧核糖核酸酶：特异水解断裂DNA分子,核酸限制性内切酶和DNA连接酶是重组DNA技术赖以创立的酶学基础,限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割 DNA连接酶用于连接两条DNA分子或片段 反转录酶以RNA
2、分子为模板合成互补的cDNA链 DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化 多核苷酸激酶将一个磷酸分子加到多核苷酸链的5-OH末端 碱性磷酸酶催化从DNA分子的5或3端移去末端磷酸基团 核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类-用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。,2. 重组DNA实验中的工具酶及其运用,第一节 核酸限制性内切酶与DNA分子的体外切割,1.1 寄主控制的限制与修饰现象,在K株或B株上生长繁殖的噬菌体（K）或（B），再次感染原寄主菌株的成斑率为1，而感染新的寄主菌株的成斑率则分别为10-4和
3、410-4,（K）在感染B菌株后长出的稀有噬菌斑中的噬菌体再次感染B菌株则可以有效地生长,两种酶的配合：修饰的甲基转移酶与核酸限制性内切酶 （EcoB and EcoK）,1.2 限制性内切酶的发现1. 细菌限制修饰系统的发现Werner Arber于1962-1968年发现，1968年分离到I型限制酶。2. 限制酶HindII的发现HOSmith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血杆菌（H. influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。3. SV40 限制图谱和转录图谱的绘制D. Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制酶谱。,国王和仆人的故事分子剪刀,
4、每当我走进父亲的办公室，总会看见他桌上放着的一些培养皿，里面装的是菌群。它们就象一个住着许多居民的城市，在每一种细菌中都有一个国王，他长得瘦瘦的、高高的。国王有很多仆人，这些仆人长得矮矮胖胖的，跟皮球差不多。父亲把国王叫做“DNA”，仆人叫做“酶”。国王就像一本书，仆人们做的每一件事情在这本书中都有记载。对于我们人类来说，国王记载的这些细目是个谜。我爸爸已经发现了其中的一个仆人，他的工作就像一把剪刀，如果有外国国王来侵犯一个细菌，这个仆人就会把他剪成小碎片，但他不会对自己的国王造成任何伤害。聪明的人类用这个带着剪刀的仆人来探究国王的秘密，他们搜集了很多带剪刀的仆人，并把他们放进一个国王里，这个
5、国王就被剪成了碎片。用这种方法得到的小碎片使人类探究国王的秘密变得容易了。爸爸就是因为发现了带着剪刀的仆人而获得了诺贝尔奖。,瑞士微生物遗传学家W阿尔伯（1929）的女儿西尔维娅,1.3 核酸内切酶的类型,1.4 I型和III型核酸限制性内切酶的基本特性,I型和III型核酸限制性内切酶一般是大型的多亚基蛋白复合物，既具有内切酶的活性又具有甲基化酶的活性。,I型核酸限制性内切酶的特性辅助因子：Mg2+、ATP和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）三种不同的亚基：特异性亚基：特异识别DNA序列修饰亚基：具有甲基化酶的活性限制亚基：具有核酸内切酶活性切割方式：结合在识别位点以滚环形式沿着DNA分子转位，而后从
6、距识别位点5一侧数千碱基处随机切割DNA分子。,III型核酸限制性内切酶的特性,辅助因子：Mg2+、ATP和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）两种不同的亚基：M亚基：位点的识别与修饰R亚基：核酸酶的活性切割方式：反应过程中会沿着DNA分子移动，并从距识别位点一侧约25bp处单链切割DNA分子。其识别序列是特异而非对称的。,1.4 II型核酸限制性内切酶的基本特性,II型只有一种多肽，通常以同源二聚体形式存在。,1.在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割DNA分子产生链的断裂；2.两个单链断裂部位在DNA分子上的分布通常不是彼此直接相对的；3.断裂形成的DNA片段往往具有互补的单链延伸末端。,识别序列
7、：双重旋转对称（回文结构）,1. 识别顺序和酶切位点）识别、6、8个相连的核苷酸,BamHI：,HhaI：,NotI：,Fok I ： 5-()9-33-()13-5 外侧，产生-端突起,IIs型,2）对称性双对称EcoRI 5-G A A T T C-33-C T T A A G-5 3）切点大多数在识别顺序之内，也有例外4）限制酶切后产生两个末端，末端结构是-和-2. 末端种类）-端突起，个数为或个核苷酸Pst I 5-CTGCAG-3 5-CTGCAOH PG-33-GACGTC-5 3-GP HOACGTC-5）-端突起，个数为或个核苷酸 EcoRI 5-GAATTC-3 5-GOH
8、PAATTC-3 3-CTTAAG-5 3-CTTAAP HOG-5,） 平齐末端SmaI 5-CCCGGG-3 5-CCC GGG-33-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5）非互补的粘性末端i）切点在识别顺序之外的，如：FokIFok I 5-GGATG()9-3 5-GGATG(N)93-CCTAC()13-5 3-CCTAC(N)13ii）能识别简并顺序的，如：AvaIAvaI 5-CPyCGPuG-3CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG,）相容性末端 如：BamHI G GATCCBglII A GATCTMboI, Sau3AI N GATCN上述几种
9、限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组分子能被MboI和Sau3AI识别和酶切。BamHI + MboI A/C/G/T GATCT/C/G/A BamHI和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切。BamHI + BglII A/G GATCT/C 。,3 同裂酶（isoschizomers）,定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶（产生同样的切割，形成同样的末端）,用以研究DNA甲基化作用： 一对同裂酶：HpaII和MspI，识别序列同为CCGG，当靶序列中含一个5-甲基胞嘧啶（CCGG）时，HpaII不能切割它而MspI则同样能切
10、开，因此可通过比较HpaII和MspI的DNA消化产物来检测胞嘧啶的甲基化。,4. 同尾酶（isocaudamer）,定义：来源不同,识别不同序列但产生相同粘性末端的限制酶,5. 限制片段末端的连接作用,许多种限制酶切割DNA分子形成的短片段能够自发地重新环化起来，用DNA连接酶处理能使它们的3-OH和5-P基团封闭起来形成永久的环形DNA分子。 两种类型：DNA分子间和分子内,1.5 限制性内切酶的命名命名原则：（1）用属名的头一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名称；（2）用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型；（3）几个不同的限制与修饰体系以罗马数字表示。例如：H
11、ind 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“”表示菌系为型血清型；“”表示分离到的第三个限制酶。 EcoRIEscherichia coli RI HindHaemophilus influensae d SacI (II)Streptomyces achromagenes I (),1.6 影响限制性内切酶活性的因素,1. DNA的纯度,DNA中的污染组分如蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS以及高浓度的盐离子都有可能抑制核酸限制性内切酶的活性。,克服手段：增加酶的用量扩大酶催化反应的体积，使得潜在抑制因素被稀释延长酶催化反应的时间,对于DNase的污染，可加入二价金属
12、离子螯合剂EDTA结合Mg2+。 加入适量聚阳离子亚精胺有利于限制性内切酶对基因组DNA的消化作用。,2. DNA的甲基化程度,采用失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒使用对甲基化不敏感的酶,3. 酶切温度,大部分酶的最适反应温度为37，但也有一些低于或高于此温度，严格参照说明。,4. DNA的分子结构,DNA分子的螺旋结构、切割靶序列所处的位置对酶切速率有影响，一些酶对不同部位的限制位点的切割活性也有差异。,5. 酶反应的缓冲液,缓冲液成分包括：MgCl2、NaCl或KCl、Tris-HCl、-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）以及牛血清白蛋白（BSA）等。 各种酶对以上成分的浓度要求都有所差异，
13、若某些酶的敏感因子浓度改变较大可能造成酶的非特异切割。,酶的星号活性： 在非最适条件下，限制性内切酶会在与其识别序列类似但并不相同的DNA序列上切割。,表1 具有星反应的限制性内切酶与条件 限制酶 诱发星活性的条件a 识别序列 AvaI 1, 2, 4 BamHI 1 - 5, 8 G GATCN, G PuATCC BstI 2, 4 BsuI 2, 4, 6 EcoRI 1, 2, 4 - 6 N AATTN Hae 2, 4 HhaI 2, 4, 7 Hind 6 HpaI 1, 2, 4 PstI 1, 2, 4, 7 Pvu 2, 4 SalI 1, 2, 4, 7 ScaI 4 -
14、 6, 8 Sst 2, 4 XbaI 2, 4, 7 a.1：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(25U/g)；5：Mn+代替Mg+；6:pH8.5; 7:二甲基亚砜(8%); 8:无NaCl。,1.7 限制性内切酶在实验中的使用,当建立内切酶酶切反应体系时有几个关键因素需要考虑。比如如何在正确的反应体系中，加入适量的DNA、内切酶和缓冲液，就可以获得最佳酶切效果。,在 50 l体系中，最适反应条件下，1 单位（U）的限制性内切酶可以在60 分钟内完全切割 1 g 的底物 DNA。,大多数科研人员会遵循右表中所列的标准反应条件，使用 510 倍的过量酶切割DNA，这样有利于克服由于 DNA 来源不同、质量和纯度不同而造成的实验失败,“标准”反应体系, 酶从冰箱取出后请一直置于冰上。 酶最后加入到反应体系中。 加入酶之前将反应混合物混匀，可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，然后在离心机中快速离心。 当切割超螺旋质粒和琼脂糖包埋 DNA 时，通常需要超过 1 unit/g 的酶量以达到完全酶切。,
