ch01_动物细胞培养基本技术

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1、Volume 3 动物细胞工程,动物细胞工程是通过对动物细胞及其组分的分工程序操作，研究生命活动的规律，实现对动物的遗传改造，结合非生物材料的手段，生产用于治疗人类疾病或缺陷的人工器官、组织、细胞及代谢产物或用于深入研究的材料等为主要研究内容的一门学科。,Chapter 1 动物细胞培养技术,本章主要教学内容： 动物细胞培养基本原理 体外细胞培养技术 动物细胞大规模培养,Section 1 动物细胞培养基本原理,一、动物细胞培养的定义 动物细胞培养是指用酶消化法将组织碎块分离成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适宜条件下，使细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。,体外培养（in vi

2、tro culture）：就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。分为组织培养、细胞培养和器官培养。体外细胞与体内细胞有何差异？,体外培养的与体内生长细胞的差异 细胞离体后，失去了体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化： 分化现象减弱 形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡，或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。 如何分化？,体外培养中细胞的分化细胞是否表现分化，关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素

3、作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。,二、动物细胞培养的发展历程 1907年，美国生物学家Harrison将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，存活数周，并观察到细胞突起的生长过程。 1923年，法国学者卡勒尔设计卡氏培养瓶培养鸡胚的心肌组织成功 1951年，厄利尔开发了供动物细胞体外培养的培养基,动物细胞基因工程：20世纪80年代以后，随着基因工程技术和细胞融合技术的迅速发展，已经能够把特定的外源基因通过PCR 技术扩增几千倍，并可转染到动物细胞内，使其得到高质量的表达。 近年来，已经启用了300

4、升和1000升的培养罐分别用于生产单克隆抗体和灰色脊髓炎疫苗。此外人体器官的培养为器官移植开辟了一条途径。,二、动物细胞培养的特点与微生物细胞培养相比，动物细胞培养有哪些特殊之处？,动物细胞培养与微生物细胞培养相比，主要有以下不同： （1）动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁； （2）动物细胞倍增时间长，生长缓慢，易 受污染； （3）培养过程需氧量少，对机械搅拌或剪 切力敏感； （4）动物细胞间主要以聚集体形式存在； （5）原代细胞一般繁殖50代左右即退化死 亡。,（6）大多数哺乳动物细胞只有附着在固体或半固体的表面才能生长； （7）动物细胞对于营养要求更加苛刻，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半

5、乳糖外，还需要血清； （8）对于培养环境的适应性更差，对环境极其敏感，包括pH 、溶解氧、温度、剪切力等都比微生物有更高的要求，一般需严格监控。,Section 2 体外培养基本技术,一、培养条件 1. 培养器具培养瓶、培养板、培养管 材料：玻璃、塑料（聚苯乙烯、聚丙烯等）、金属,2. 温度与多数哺乳类动物体内温度相似，培养细胞的最适温度为37，偏离此温度， 细胞的正常生长及代谢将会受到影响甚 至导致死亡。3. 细胞培养的无菌环境,二、培养基 （一）细胞培养基的基本要求： 体外培养的细胞直接生活在培养基中，因此培养基应能满足细胞对营养成分、促生长因子、激素、渗透压、pH、无毒、无污染等诸多方面

6、的要求。 细胞培养基其组成成分主要有：水、氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子及激素等,1.水与平衡盐溶液 （1）培养用水 体外培养的细胞对水质特别敏感，对水的纯度要求较高。配制培养用液应使用经石英玻璃蒸馏器三次蒸馏的三蒸水或超纯水净化装置制备的超纯水。最好用龙头瓶贮存，存放时间一般不应超过2周。 （2）缓冲溶液、生理盐水、平衡盐溶液,2. 渗透压 细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。人血浆渗透压290mOsm/kg, 可视为培养人体细胞的理想渗透压，鼠细胞渗透压在320mOsm/kg左右。对于大多数哺乳动物细胞，渗透压在260320mOsm/kg的范围都适宜。,3.

7、 气体 O2参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分。一些细胞在缺氧情况下，借糖酵解也可获取能量，但多数细胞缺氧不能生存。在开放培养时，一般置细胞于95空气加5CO2的混合气体环境中培养。CO2既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，它主要与维持培养基的pH有直接关系。,4. pH动物细胞大多数pH值约在7.27.4 (6.87.6)在封闭式培养过程中CO2与水结合产生碳酸，培养基pH很快下降。为解决这一问题，合成培养基中使用了NaHCO3-CO2缓冲系统，并采用开放培养，使细胞代谢产生的CO2及时溢出培养瓶，再通过稳定调节温箱中CO2浓度（5），与培养基中的NaHCO3处于平衡状

8、态。,（二）天然细胞培养基 天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早期，体外培养细胞都是利用天然培养基。但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使用的天然培养基是血清，另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。,血清(serum)细胞培养的发展，培养基的质量是关键，而在培养基的主要成份中，动物血清对细胞的生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用。在动物血清的应用中牛血清是最为广泛的，血清是医药生物技术产品中重要的原材料之一，保证血清质量也是促进生物制品

9、质量提高的重要环节。,1.血清种类:目前用于组织培养的血清主要是牛血清，培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。 选择用牛血清培养细胞的原因：来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。 牛血清分为：小牛血清、新牛血清、胎牛血清。,2.血清的主要成分血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，其组成成份（血清的成份可能有几百种之多）虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。

10、,3.血清主要作用： 提供基本营养物质氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质。 提供激素和各种生长因子 激素：胰岛素、肾上腺皮质激素（氢化可的松、地塞米松）、类固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。 生长因子：成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。,提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要的低分子量物质如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。 提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。 对培养中的细胞起到某些保护作用：有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。,

11、4.细胞培养中使用血清的缺点 对大多数细胞，在体内状态，血清不是它们接触的生理学液体，只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清，因此使用血清有可能促进某些细胞的生长（成纤维细胞），同时抑制另一类细胞生长（表皮细胞）。 血清含一些对细胞产生毒性的物质，如多胺氧化酶，能与来自高度繁殖细胞的多胺反应（如精胺、亚精胺）形成有细胞毒性作用的聚精胺。,动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致。 取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠性。 血清的使用使得实验和生产的标准化困难，其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产中的分离纯化工作

12、很难完成。 价格昂贵，是构成动物细胞培养对生产成本的主要部分之一。,5.血清的质量标准血清质量高低取决于两方面因素： 取材对象 取材过程血清必须严格执 行相应的标准,血清质量的鉴定一般包括以下几个方面 理化性质：如渗透压、pH值、蛋白电泳图谱、蛋白含量、激素水平、内毒素等 微生物检测：包括细菌、真菌、支原体、病毒等。特别是对支原体、病毒的检测 促生长效果：这是血清重要的特性之一，应当以培养的细胞来检测。好的血清应该是透明清亮，土黄色或棕黄色，无沉淀或极少沉淀，比较粘稠。,6.血清的使用与储存正确的使用及保存血清，才能使血清发挥应有的作用。 （1）使用前处理：大部分血清在使用前必须灭活处理，即5

13、6，30分钟。灭活的目的是去除血清中的补体成分，避免补体对细胞产生毒性作用。,（2）储存条件血清一般储存于20，同时应避免反复冻融。购买血清后，首先要灭活处理，然后分装成小包装，储存于20，使用前置于4融化。 （3）使用浓度使用浓度一般为520（合成培养基），最常用是10。过多血清容易使培养中的细胞发生变化。,合成细胞培养基,（三）合成细胞培养基合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成、人工设计、配制的培养基。 1. 基本培养基 包括：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物、水。,（1）无机盐细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮和磷等基本元素，还需要微量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等

14、。 CaCl2、KCl、MgSO4、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4，对调节细胞渗透压、某些酶的活性以及溶液的酸碱度都是必须的。,（2）氨基酸是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要12种必须氨基酸：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、组氨酸、酪氨酸、精氨酸、胱氨酸(L型) 。此外还需要谷氨酰胺，它在细胞代谢过程中有重要作用：细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏可导致细胞生长不良甚至死亡。,（3）碳水化合物是细胞生命的能量来源，有的是合成蛋白质和核酸的成分。培养中的细胞可以进行有氧与无氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核

15、酸的原料。细胞对葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。体外培养动物细胞时，几乎所有的培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含的能源物质。,（4） 维生素主要扮演辅酶、辅基的角色，必不可少。生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B12都是培养基常有的成分。,2. 促生长因子及激素 已证实，各种激素、生长因子对于维持细胞的功能、保持细胞的状态（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素对许多细胞生长有促生长作用，如胰岛素，它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素对某一类细胞有明显促进作用，如氢化可的松可促进表皮细胞的生长，泌乳素有促进乳腺上皮细胞生长作用等。,3.其他成分 酚红：一种pH

16、指示剂，当溶液酸性时pH小于6.8呈黄色；当溶液碱性时pH大于8.4呈红色(红色-pH7.4，橙色-pH7.0，黄色-pH6.5，蓝红色-pH7.6，紫色-pH7.8)。 在较为复杂的培养液中还包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶两类)，以及氧化还原剂(如谷胱甘肽)等 有的培养液还直接采用了三磷酸腺苷和辅酶A (HS-CoA),（四）无血清技术及无血清培养基 经历了天然培养基、合成培养基后，无血清培养基和无血清培养成为当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养可降低生产成本，简化分离纯化步骤，避免病毒污染造成的危害。无血清培养基(serum free medium, SFM)是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。,无血清培养基的基本配方： 基础培养基及添加组分两大部分 添加组分包括以下几大类物质： 促贴壁物质：一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等 促生长因子及激素：胰岛素、生长激素 酶抑制剂：须含胰酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的 结合蛋白和转运蛋白：转铁蛋白等 微量元素：硒,