聚合酶链式反应PCR

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1、第六章 聚合酶链式反应,聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction, PCR)80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个 ephendof 管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍。,发展简史,Korana 于1971 年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过 DNA 变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆 tRNA 基因”。1985年美国 PE-Cetus 公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了聚合酶链反应。其原理类似于DNA

2、的体内复制 , Klenow 酶催化，PCR 产物特异性较差，合成的 DNA 片段不均一。,1988 年初，Keohanog 改用 T4 DNA 聚合酶进行PCR，其扩增的 DNA 片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种 DNA 片段。 1988 年 Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA 聚合酶，Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使 PCR 广泛的被应用。,PCR 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。类似于 DNA 的体内复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

3、模板 DNA 变性：模板 DNA 经 93左右加热一定时间后，双链 DNA 模板或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离成为单链。 模板 DNA 与引物的退火(复性)：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合。 引物的延伸：DNA 模板-引物结合物在 Taq DNA聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的单链。,第一节 聚合酶链式反应扩增原理,变性-退火-延伸三步骤的重复循环，就可获得更多的“模板互补链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。多次循环后目的基因

4、扩增放大几百万倍。DNA 扩增量呈指数上升。反应最终的 DNA 扩增量可用 Y(1X)n计算。Y 代表DNA 片段扩增后的拷贝数，X 表示每次扩增效率的平均值，n代表循环次数。 平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序列 DNA 片段的增加呈指数形式，随着PCR 产物的逐渐积累，被扩增的 DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期 (Plateau)。,第二节 聚合酶链式反应体系,一、聚合酶链式反应操作程序通常进行聚合酶链式反应，主要考虑反映体系 、反映参 数和 DNA 变性时间与终变时间三个方面内

5、容 。,（一）反应体系聚合酶链式反映体系的总体积依试验要求而定 。例如，在 50ul 聚合酶链式反应（PCR）体系中，加入下列试剂：20 pmol上游引物和 20 pmol下游引物 ，20 mmol/L Tris-Hcl (pH8.3, 20 )、1.5 mmol/L MgCl2 、25 mmol/L KCl、 0.05% Tween 20 、100ug/ml 明胶或无核酸酶的牛血清蛋白、50 umol/L dNTP、 2U Taq DNA 聚合酶、 100200 ng DNA 模板，将试剂混匀。,（二）反应参数聚合酶链式反应（PCR）参数包括循环中三阶段的温度及持续时间控制，以及循环的次数，

6、这在一定程度上影响着聚合酶链式反应的成功与否 。通常 PCR 反应所采取的反应参数为：变性温度 95 60s退火温度 3865 60s延伸温度 72 12s循环次数 3035次复性温度决定于所用引物的长短与碱基组成，一般需要通过实验来确定。,为了使模板 DNA 双链充分打开 ，开始时模板 DNA 变性要适当延长，一般设预变性（predenature) 94 35 min。一般在扩 增完成后，PCR 产物中可能含有长短不一的分子，都需要一步长时间的延伸反应，称为终延伸（post extention），时间要保持在10 min 左右，以获得尽可能完整的产物，这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。反应

7、终止后，可以放到4 中保存，以备电泳检测。,（三）DNA变性时间与终延伸时间,二、聚合酶链式反应的成分 （一）引物在聚合酶链式反应中，要注意所用的引物浓度，一般引物控制在 20200 pmol,这种浓度通常足以保证进行30轮以上的扩增。引物浓度偏高，会引起错配和菲特异性产物的扩增，同时增加生成引物二聚体的几率。相反 ，如引物浓度不足，则聚合酶链式反应的效率极低,（二）DNA聚合酶 比较常用的酶有： 1.大肠杆菌 DNA聚合酶大片段 （Klenow 片段）它是 DNA 聚合酶经枯草杆菌蛋白酶处理后，产生分子量为 7.6104 的大片段 分子 。具 5 3 DNA 聚合酶活性 ， 3 5 外切酶活

8、性，其具体用途为： （1）补平经限制性内切酶消化 DNA 所形成的 3 凹端及对 3 凹端进行放射性标记； （2）在 cDNA 可隆中 ，因此合成 cDNA 第二链。 （3）用于 Sanger 双脱氧末端终止法进行 DNA 的 序列分析。,是一种耐热的依赖于DNA 的 DNA聚合酶，最初是从极端嗜热的栖热水性菌中醇化出来的。目前，基因工程产品 Ampl:Taq TM有出售；功能： 具 5 3 DNA 聚合酶活性，5 3 外切酶活性；特点：高度耐热，最佳温度 75 80;在序列分析和 PCR 中应用广泛.,2.Taq DNA聚合酶,3. T4DNA聚合酶功能： （1）具5-凸端补平效果 （2）

9、5 3 外切酶活性 （3） 3 5 外切酶活性 （4）用与制备探针和加减法DNA序列分析,（三）三磷酸脱氧核苷酸一般商品化供应的 dNTP 溶液 pH为7.0，各 dNTP 的 浓度为 2.5 mmol/L,一般使用浓度控制在 20200 umol/L。四种各 dNTP分子浓度必须相等，以减少错配。 （四）镁离子镁离子浓度对 PCR 反应影响很大，既影响到 Taq DNA 聚合酶的活性和真实性，又影响到引物退火、模板和 PCR 产物的解链温度、产物的特异性以及引物二聚体生成等。PCR 体系中的酶离子浓度在 0.52.5 mol/L。,（五）模板聚合酶链式反应（PCR) 的模板 DNA 可以是单

10、链分子，也可以是双链分子；可以是线状分子，也可以是环状分子，不过线状分子比环状分子的扩增效果稍好。就模板 DNA 而言，影响 PCR 的主要因素是模板的数量和纯度。 （六）其他反应成分1. Tris-HCl在聚合酶链式反应 (PCR) 中使用 1050 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3, 20). Tris 缓冲液是一种双极化离子缓冲液，温度每升高一度，pH值下降 0.02，因此在典型的热循环条件下，其 pH 值在 6.87.8 之间变化。,2. KCl 浓 50 mmol/L 时，能促使引物退火。但在 NaCl 浓度50 mmol/L，KCl 的浓度大于 50 mmol/L时，

11、将会抑制 Taq DNA 聚合酶的活性。 3. DMSO在使用 Klenow 大片段进行 PCR 时，二甲基亚砜(DMSO) 是有用的。但其浓度超过 10% 将会抑制 Taq DNA 聚合酶 50% 的活性，所以，大多数人不使用DMSO。 4.其他成分如明胶、牛血清蛋白、非离子型生物去污剂 ，能帮助酶的作用。,三、聚合酶链式反应的条件 （一）变性的时间和温度模板 DNA 和聚合酶链式反应 (PCR) 产物的变性不充分是 PCR 失败的重要原因。一般在第一轮循环前先进行 94 预变性 310min，以便使模板 DNA 完全解链，然后加入 Taq DNA 聚合酶趁热启动，这样可减少聚合酶在低温下仍

12、有活性而引起的非特异性扩增。,（二）引物的退火引物的退火温度和所需时间长短取决于反应体系中扩增的基因组成及引物的长度、浓度和碱基组成。实际使用的退火温度要比引物的 Tm 低 5 。退火温度在 5572 之间都会得到好的结果。一般当引物中 G+C 含量高、长度较长并与模板完全配对时，应提高退火温度。退火温度越高，所得产物的特异性越高。当然，退火温度叶不能过高，否则引物不能与模板很好得结合，得不到扩增产物。退火通常需要 3060s。,延伸的时间长短取决于目的序列的长度、浓度及延伸温度的高低。一般引物延伸是在 72 下进行。对 2 kb长的产品扩增时间多采用 1 min（ 72 ）。,（三）延伸时间

13、和温度,引起平台效应的因素： （1）dNTP 或引物等消耗殆尽 （2）酶活性逐渐降低 （3）最终产物的阻化作用（焦磷酸盐、双链 DNA） （4）非特异性产物或引物的二聚体与反应模板的竞争作用 （5）浓度在 10-8mol/ 时的特异引物的重退火（延伸率降低，TaqDNA 聚合酶消耗，产物链分叉，引物移位）,（四）平台效应,第三节 聚合酶链式反应引物设计原则,一、引物设计的一般原则 （1）引物长度应为 1530 个核苷酸，Tm 可按下列简单公式计算：Tm =（G+C）*4+（A+T） *2 （2）引物中碱基的分布应当是随机的，避免出现一连串的单一碱基或产生二级结构。 （3） G+C 碱基的含量在

14、 45%55 % 左右。 （4）两个引物在 3 端均必须与模板互补，5端可以不互补。 （5）引物自身连续互补碱基小于 4 个。 （6）引物之间连续互补碱基亦应小于 4。,二、引物3 末位碱基引物3 末位碱基在很大程度上影响着TaqDNA聚合酶的有效延伸。实验表明，引物3 末位碱基存在错配时，不同碱基的引发效率存在很大的差异。三、引物设计软件,第四节 聚合酶链式反应技术类型,一、已知DNA序列的聚合酶链式反应扩增 （一）巢式PCR巢式 PCR 是为了增加扩增的灵敏度，对已知序列设计出第一对引物，扩增 25 个循环。然后根据序列设计出第二对引物，它和已扩增出序列内部两条链序列互补，继续再扩增 25

15、 个循环。如此，不受平台效应的限制，而且比单一的一对引物 PCR 扩增灵敏度特异性高 1000 倍。,（二）热巢式 PCR是巢式 PCR 的改进技术。 （三）半巢式 PCR为了节省材料，往往在设计巢式引物时，利用第一对引物中的一个引物，再从 靶序列内部设计出另一个引物，效果与巢式 PCR 相同。 （四）不对称 PCR不对称 PCR 多用于序列分析。 （五）等位特异性 PCR等位特异性 (allele specific) PCR，即 AS-PCR，又称扩增受阻突变体系（amplification refractory mutation system, ARMS）, 是为检测点突变而设计的。,（六

16、）PCR-单链构象多态 1、原理和方法 PCR-单链构象多态 (single strand conformtion polymorphism, SSCP) 2、特点PCR-单链构象多态 (PCR-SSCP) 的优点是简单、快速、灵敏度高，可同时处理多个样本。 3、应用,（七）竞争引物 PCR竞争引物 PCR（COP-PCR）针对靶 DNA 一个测点突变设计出两个等位特异性寡核苷酸（allele specific oligonucleotide , ASO），一个为正常引物，另一个为突变引物。 （八）降落PCR降落（TD）PCR 代表了一种完全不同的 PCR 优化方法，它不是用许多反应管和每管用不同的试剂浓度和（或）循环参数，而是一个反应管或一小组反应管，在适合于扩增目的产物而的不到人为产物或引物二聚体的循环条件下反应。,