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1、稻瘟病（ Magnaporthe grisea ）研究进展,一.前言,Mangaporthe grisea（Hebert）Barr 是异宗配合的子囊菌，它主要引起早熟禾科（Poaceae）许多种的病害。 完全可育菌系是自身可育的雌雄同株体，具有交配位点 Mat I等位交换给予交配亲和性。最近已报道，从瓶状体产生新月形小分生孢子（平均大小6m长，0.7m宽），是由菌管产生的 稻瘟病菌根据其在不同水稻栽培品种的致病力不同分为若干个小种或致病小种。 关于稻瘟病菌致病性变异的程度与致病小种之间的联系已引较大争议。,遗传研究已能确定稳定的和不稳定无毒基因，虽然这些研究中描述不稳定的程度没有出现象欧世璜报
2、道那样极度异常。 直接从田间来的病菌分离菌株所表明的可育性的程度高度不同，从高度可育雌雄同体，到完全不育的菌系，雌性可育菌系，仅仅与雌雄同体交配。 大多数从田间分离的水稻病菌可育性很差,对水稻上的致病菌进行遗传分析 细小染色体是否是导致低可育性的原因，但已经显示小染色体与低水平的可育性之间有相关性。 现已进行限制性片段长度多态性（RFLP）图谱，克隆致病基因 已有的细胞学研究已表明M. grisea有6个染色体,核型研究已鉴定了7个连锁群。图谱事例将可产生对稻瘟病研究有价值的资源，已描图控制寄主专化性的几个基因，根据图谱位置已克隆2个寄主专化性基因 .,已克隆具有潜在的或已被证实了作用的致病性
3、基因，现在充分证明通过基因干扰技术零点突变产生,二、M.grisea群体,1M.grisea 种内的寄主专化性,分子分析现正在确定M.grisea的寄主种专化性的亚群体。核糖体DNA多态性分析（RFLP和ITS序列）确定至少6个主要的病原菌单模式，每一个有一组限制性寄主种专化模式。 水稻、稷属多个种（Eleusine spp）、 小麦，相对应1、2、3 rDNA类群，显示密切相关，ITS核苷酸0.3和1%差异，4、5、6 rDNA 群基因型与先前的类群和彼此之间高度不同，ITS序列差别范围为6-89%。线粒体DNA序列多态性分析能独立确定寄主专化性单模式。,水稻、小麦和稷属（Eleusine）
4、病原菌有密切相关线粒体DNA（mtDNA）类型，Ia、Ib、Ic和Ie，其大小为1个或2个限制性片断的小差异。 水稻病原菌属于单一群体，稷属（Elousine）和马唐属（Digitaria）病原体，每一类是分成两个密切相关群体，而狼尾草属（Peurisetum）病原菌属于两个较远的相关群体。,2稻瘟病菌群体的无性谱系,从田间和地理位置的隔离的相对交配型菌系的菌株生殖水平低，表明侵染水稻的田间群体主要是无性繁殖。 Levy等（1991）通过用中间重复DNA序列亚克隆为pCB586的分子分析稻瘟菌群体。清楚论证稻瘟病菌群体的无性特征，在稻瘟菌中，MGR 586指纹有50以上可改变的EcoR I片段
5、，范围0.7-20kb，这些片段是分散在所有的染色体上.Levy证实了在南美洲病菌群体分为8个明显不同的类群（谱系），且每一个类群是通过同一祖先无性繁殖所致。,指纹分析现已经在世界范围确定这些类群。这一简单从把稻瘟病菌类群看作为几组固定的谱系，比在不同的水稻栽培品种上通过毒力测试确定几百水稻致病类型结构来说提供更多的信息。,如果谱系信息有预测病菌分离株的小种结构和这些分菌株的潜在变异，群体中谱系结构对育种者应当是非常有意义。 含金字塔形的谱系专化抗病基因为基础的谱系专化性育种策略，有效抵抗一个特殊无性群体的所有菌系，在水稻中有可能推进持久抗性育种。,三、致病的分子机理,1侵入 2扩展 3孢子形
6、成,1侵入,稻瘟病菌已进化了一种复杂的机械侵入寄主组织的机理，使用一种专门的附着胞，可能产生最高的所知膨胀压。,附着胞发育特征包括附着胞孔，与基质相连接，孔壁的覆盖物，和有局部浓缩的侵入栓,细胞外的粘液和胶质物在侵入过程起关键作用。 遗传或化学方法阻止黑色素DHN的生物合成，使附着胞不能产生侵染功能。沉积在原生质膜和附着胞壁较厚一层黑色素，在附着胞内对可溶性小分子渗透性起着栅栏作用。对构建巨大的侵染栓压力起关键作用，估计在8obar，对非生物降解，人工表面病菌使用机械侵入方式，调节压力。构建的可溶性分子可能来源于糖原的分解，因为在侵入前压力构建期，细胞质糖原球体消失。,限定在表皮细胞的酶也可能
7、在渗透过程起作用.Weigard 等克隆了M. grisea角质酶基因，CUTI，但是CUTI基因功能的丧失对致病性没有明显的影响。 Lee and Deau(1994)表明疏水性是关键因素,硬度是诱导因素的关键 似乎表面局部解剖学与诱导性之间无关。疏水的玻璃表面诱导的矛盾性结果可能由于菌株不同，或对有多种物质污染的表面系统的敏感性，可能刺激附着胞的形成。,Talbot等鉴定了MPG1，在侵染结构起修饰作用的基因 克隆的MPG1基因编码一小的，分泌富含半胱氨酸的蛋白质，具有病菌疏水的特性。 Lee和Dean证明 cAMP在干扰侵染结构形成时起的作用。加入外源的cAMP和筛选的cAMP类似物，在
8、非诱导的表面刺激对附着胞的形成。,2扩展,狭窄侵入栓膨大形成初生菌丝，随后有差别的成为一种膨大的鳞茎形的次生菌丝，通过寄主组织扩展。 病菌在植物组织内鳞茎形状的菌丝明显不同在琼脂培养基上的细长丝状菌丝，可能是为了适应寄主组织不利的生存环境。,若干对植物具毒性的病菌代谢物在稻瘟病菌致病过程起作用。 细格孢酸CTA，来源一种环化的乙酰基异亮氨酸。在植物保素中具代表性的，因为与真菌的培养繁殖有联系。 TA被认为决定寄主定殖的范围时起作用。,3孢子形成,M.grisea 分生孢子的形成是全裂的，一个分生孢子通过分生孢子梗的顶端膨胀产生，然后分生孢子梗顶端向一边生长产生下一个分生孢子，在成熟的分生孢子梗
9、产生多个合轴的分生孢子。 Conl-至Cno7-，是经REMI转化作用，使用化学诱变剂或扦入诱变方法分离的。两个突变体，Con5-和con6-，没有产生任何分生孢子，其它五个类型突变体显示出孢子的形成减少和发育缺陷。,四寄主专化性的遗传控制,1. PWL寄主专化基因族 2AVR2-YAMO无毒基因族,遗传分析鉴定2个基因，来自狗尾草病菌的PWL1，来自水稻病菌的PWL2，各自对M.grisea菌系侵染弯叶画眉草能力起主要作用。 在水稻致病系统是典型的基因对基因系统，病菌中的AVR基因与寄主中特定的抗病基因功能性表现对应关系。 许多研究确定单一基因控制水稻品种的专化性，一些研究显示复杂分离现象，
10、有2个或多个致病基因控制特定寄主专化性。,1. PWL寄主专化基因族,PWL2，来自稻瘟病菌Guy11的专化基因控制侵染弯叶画眉草的能力，在实验室研究中出现遗传不稳定性。非致病的模式菌株频频出现致病突变体 PWL2基因编码一个富含甘氨酸，疏水多肽，包括145个氨基酸区域,在多种杂草种病原M.grisea中表明与PWL2有同源性的DNA序列的分布。 水稻的多数病菌和马唐属的病菌含有与PWL2相似的同源序列。 稷属病菌同源性较少。 含有PWL1基因的病菌与PWL2有较少同源性片断，这种同源性导致克隆PWL1基因的全部功能。,第二个惰性基因，PWL3，来自同一稷属病菌和另一个惰性基因PWL4来自弯叶
11、画眉草，都已克隆。克隆的PWL3基因编码一个无活性的蛋白质，PWL4基因编码一个活性的蛋白质，但不表达 PWL1、PWL3和PWL4蛋白质分别与PWL2蛋白质有74、49和55%相似性，PWL基因看来是一个动态的，快速进化的基因族。,2AVR2-YAMO无毒基因族,AVR2-YAMO基因整个存在在一个调聚15kbDNA片断内。这个基因编码含223氨基酸的蛋白质。 在水稻病菌、马唐属病菌和狼尾草属病菌中，存在AVR2-YAMO较高同源性的序列。,五M.grisea遗传不稳定性新的观点,1与染色体位置相关的不稳定性2转位因子,高变异不是M.grisea基因的一般特征 寄主除专化性基因PWL2和AV
12、R-YAMO外某些遗传位点至少在病菌的某些菌株中是不稳定的。 从世界范围内收集的许多水稻病菌显示出对BUF1黑色素生物合成基因的表达的遗传不稳性,这种不稳定性也在减数分裂时发生。 在M.grisea变异潜在机制包括像B染色体，准性循环，或在双链RNAS多态性。 在病菌中遗传不稳定看来与基因组不稳定区频繁的正常发生的缺失和其他突变有关。 在其它一些情况中，至少在实验室研究中，转位也导致变异。,1与染色体位置相关的不稳定性,克隆的不稳定的遗传位点中的2个，PWL2和BUF1，经常发生缺损。检测所有自发发生的PWL2突变体已经缺失了PWL2基因和至少30kbDNA序列,发现来自从不同的亲本菌株的突变
13、体分析，两或 三类不同缺失。 所有检测的自发Buf-突变株包含BUF1基因和邻近基因组序列的缺失。,一个较大范围的遗传事件导致AVR2-YAMO基因在其调聚位点失活 中国的谱系的菌株有同样大小AVR2-YAMO E coR I片断（大约1.8kb） 菌株有AVR2- YAMO调聚位点，具有与那些研究相似的遗传不稳定性结果。,2转位因子,转位因素提供了一个可证实的M.grisea遗传变异的来源。已确定4簇的转位因子，同时几个明显没有特征的重复DNA序列。包括一个推断回复因素，即名为MGR538,2个回复转位子 一个回复转位子（retrotranposon），命名Fosbury或MAGGY。 另外
14、一个名叫grass-hopper 已有对2个M.grisea因素（Fosbury和Pot2）活跃的转位作用证据。Shull(1995) 鉴定一个新的MGR586RFLP仅存在一个完全四分体的八个成员中的一个。,六结论,插入诱变技术正在鉴定，致病性或孢子形成的所要求的基因。 不同的cDNA 克隆技术在鉴定附着胞形成期间所表达的一些基因或病菌在寄主植物侵染性生长期表达的一些基因。 使用基因干扰技术突变分析已有可能鉴定克隆的一些基因的功能。,主要的突破将来自发现单个AVR基因作用，例如PWL2和AVR2-YAMO对病菌起什么作用。 具有致病性要求的AVR基因可能与持久抗性基因相对应，这些基因在田间仍然有效，因为病菌必须保持相应的AVR基因。 群体研究鉴定有菌系中特定克隆谱系内保留的AVR基因，与AVR基因相反，在一些菌系中存在，而另一些菌系没有，可以给这些病菌在田间适应性的关键功能提供线索。因此，AVR基因的研究也可能对致病过程关键机理及分子深入地了解。,
