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1、,骨桥蛋白在炎症性肠病发病机制中 作用的研究,作者：#,#,前言,材料和方法,结论,结果,一 前言,二 材料与方法,三 结果,四 结论,又称为Spp1(分泌型磷酸糖蛋白1)或ETA-1(早期T淋巴细胞活化因子)，是一种多功能的胞外基质蛋白，表达于多种组织和细胞中； 有两种形式：分泌型骨桥蛋白( sOPN)和胞内型骨桥蛋白 (iOPN)； 早期研究发现，OPN能够抑制炎症反应的发生，但在不同的环境中OPN的作用可能会表现出不同的侧重。,骨桥蛋白(OPN),研究背景,累及全消化道的一种特发性肠道炎症性疾病； 病因和发病机制尚未完全明确，已知肠道黏膜免疫系统异常反应所导致的炎症反应在IBD发病中起重
2、要作用； 研究发现，OPN在炎症性肠病患者发炎的肠道组织中的表达增加。,炎症性肠病（IBD）,对患者会产生何种影响？,问题,一 前言,二 材料与方法,三 结果,四 结论,研究目的,（1）采用 IBD 小鼠模型实验观察 OPN 缺失对小鼠自发性结肠炎的影响,（2）研究骨桥蛋白在炎症性肠病发病机制中的作用,二 材料与方法,一 前言,三 结果,四 结论,研究对象,临床症状,临床评分标准,体重下降超过5%,脱肛,腹泻,二 材料与方法,一 前言,三 结果,四 结论,对IL-10 KO 和 OPN/IL-10 DKO 小鼠的临床症状表现进行评分。出现该临床症状计1分，否则为0。合计得出总分。,肛周粘液分泌
3、物,二 材料与方法,一 前言,三 结果,四 结论,实验方法与步骤,患结肠炎小鼠结肠组织切片微观分析,基因表达定量分析,荧光原位杂交技术（FISH）检测分泌的磷蛋白1基因编码区OPN,酶联免疫吸附法量化上清液中TNF-、IL-6、IL-12p40含量,小鼠肠粘膜固有层单个核细胞的分离,末端限制性片段长度多态性分析,提取小鼠腹腔巨噬细胞分析吞噬作用,肠系膜淋巴结细菌种类的鉴别,统计分析(非参数Mann-Whitney U 检验或Bonferroni校正单向分析),8,7,6,5,4,3,2,1,9,10,小鼠骨髓衍生的巨噬细胞的 准备和刺激,二 材料与方法,一 前言,三 结果,四 结论,实验方法与
4、步骤,1.提取mRNA（异硫氰酸胍-酚氯仿法）； 2.进行反转录（SuperScript II反转录酶）； 3.分析互补DNA对GAPDH，IL-6，IFN-，IL-17A和CD11bmRNA的表达（LightCycler 480 System II）； 4.目的基因以GAPDH为参照标准。,基因表达定量分析,GAPDH 5-CAA CTTTGT CAA GCT CAT TTC C-3(正) 5-GGT CCA GGG TTT CTT ACT CC-3 (反) IL-6 5-AGT CCG GAG AGG AGA CTT CA-3 (正) 5-ATT TCC ACG ATT TCC CAGAG
5、-3 (反) IFN- 5-AGC TCT TCC TCA TGG CTG TT-3 (正) 5-ATC TGGCTC TGC AGG ATT TT-3 (反) IL-17A 5-TCT CTG ATG CTG TTG CTG CT-3 (正) 5-CGT GGA ACG GTT GAG GTA GT-3 (反) CD11b 5-GCT CCG GTA GCATCA ACA AC-3 (正) 5-AGT GAA TCC GGA ACT CGT CCG-3 (反),引物序列,二 材料与方法,一 前言,三 结果,四 结论,实验方法与步骤,1.小鼠股骨和胫骨骨髓中提取骨髓细胞； 2.含10%热灭活的
6、胎牛血清，100mg/ml链霉素，100mg/ml 青霉素和40ng/ml重组巨噬细胞集落刺激因子RPMI1640培养液中37C培养5天； 3.衍生的巨噬细胞按5105个细胞/孔接种于6孔培养板，经10ng/ml IFN-隔夜孵化后，用以下刺激物（Pam3CSK4 50 -500 ng/ml、LPS 100 ng/ml、ODN1585500 nM）刺激细胞24h； 4.吸取上清液-80冷冻保存备用。,小鼠骨髓巨噬细胞的准备和刺激,二 材料与方法,一 前言,三 结果,四 结论,实验方法与步骤,1.小鼠结肠组织切片，PBS冲洗； 2.含5 mM EDTA 和1 mM二硫苏糖醇汉克平衡盐缓冲液中去除
7、上皮细胞； 3.含0.5 mg/ml 胶原酶D、0.5 mg/mlDNA酶I、3 mg/ml DispaseII PBS中用37摇床孵育30分钟慢速旋转，弃上清用40%的Percoll分离液重悬，80% Percoll分离液覆盖； 4.离心后即可在两层Percoll液的界面上获取LPMCs，PBS洗涤 5.LPMCs中提取RNA,小鼠肠粘膜固有层单个核细胞的分离,二 材料与方法,一 前言,三 结果,四 结论,实验方法与步骤,1.小鼠盲肠置于含100 mM 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(pH 9.0)、40 mM 乙二胺四乙酸、4 M 硫氰酸胍 0.001% 溴麝香草酚蓝的溶液中，分解悬浮物中的粪便，
8、提取粪便DNA； 2.5-FAM-labeled 516f 和1510r 作引物从粪便DNA中生成16 s rRNA扩增子，10 U of Bsl l 处理3小时，ABI PRISM 3130xl基因分析仪进行分馏； 3.OTUs分析13 bp长度末端限制性片段，得到T-RFLP文件，进行主成分分析。,末端限制性片段长度多态性分析,二 材料与方法,一 前言,三 结果,四 结论,实验方法与步骤,1.小鼠腹腔注射3mL4%巯乙酸，第4天获取腹膜渗出细胞。去除红细胞，使用抗CD11b磁珠选择CD11b阳性thioglycollate诱导的腹膜巨噬细胞(TEPMs)； 2.TEPMs按2.5105个细
9、胞/孔接种于96孔培养板，经含40 ng/ml重组巨噬细胞集落刺激因子的RPMI 1640中隔夜孵化，PBS清洗，在这些孔中，分别增加重组OPN浓度1, 10, 100, 1000 ng/ml，细胞在37C培养； 3.在活细胞成像溶液中用荧光粒子稀释,用荧光酶标仪在指定时间测量荧光强度。 4.所有实验孔中，通过减弱阴性对照孔平均荧光强度评估吞噬活性,小鼠腹腔巨噬细胞的提取和吞噬作用分析,二 材料与方法,一 前言,三 结果,四 结论,实验方法与步骤,1.在无菌条件下获得MLNs，提取细菌DNA； 2.通用引物(27F； 5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3, 1492R；
10、5-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3)扩增细菌的16s rRNA，内引物(35F；5-CCT GGC TCA GGA TGA ACG-3；519R；5-ATT ACC GCG GCK GCT C-3)扩增巢式PCR； 3. 1%琼脂糖凝胶电泳扩增产物，用QIAEX II凝胶萃取设备提纯，绑定到PCR4-TOPO载体，使用TOPO-TA克隆工具将其转变为E. coli TOP10 细胞; 4.TempliPhi系统扩增16S rRNA基因，用作DNA测序模板。ABI 3730 DNA分析仪进行分析，从日本DNA数据库中对应所有条目，BLAST分析检查所有的核苷酸序列，用DN
11、A序列分析软件进行匹配。,肠系膜淋巴结细菌种类(MLNs)的鉴别,三 结果,二 材料与方法,一 前言,四 结论,OPN KO小鼠没有出现自发性结肠炎,OPN KO小鼠直肠组织HE-染色剂图像,WT小鼠和IL-10 KO小鼠直肠组织OPN基因的表达,IL-10 KO和OPN/IL-10 DKO小鼠临床得分随时间的变化情况,OPN缺失导致IL-10 KO小鼠结肠中合成OPN mRNA增多,OPN/IL-10 DKO小鼠表现出结肠炎症状,三 结果,二 材料与方法,一 前言,四 结论,IL-10 KO 和 OPN/IL-10 DKO小鼠组织学得分变化情况（左）和4周龄直肠组织HE-染色剂图像（右）,4
12、周龄 IL-10 KO和OPN/IL-10 DKO小鼠结肠组织IL-6、IFN-和IL-17A基因表达,OPN/IL-10 DKO小鼠很快发生结肠炎，而在4周龄发生免疫细胞浸润增多和显著的直肠上皮增生,OPN/IL-10 DKO小鼠结肠组织中促炎性细胞因子的基因表达比IL-10 KO小鼠多,三 结果,二 材料与方法,一 前言,四 结论,4周龄的WT、IL-10 KO和 OPN/IL-10 DKO 小鼠直肠组织OPN mRNAFISH图像,IL-10 KO小鼠直肠组织合成OPN mRNA更多,4周龄IL-10 KO小鼠直肠组织OPN mRNA FISH图像(红) E-cadherin免疫荧光染色
13、(绿),IL-10 KO小鼠结肠上皮细胞OPN的合成增多,三 结果,二 材料与方法,一 前言,四 结论,3周龄IL-10 KO小鼠和OPN/IL-10 DKO小鼠粪便样本T-RFLP数据,主要成分分析T-RFLP 数据,IL-10 KO小鼠和OPN/IL-10 DKO小鼠肠道细菌组成有明显差异,OPN/IL-10 DKO小鼠有更低丰度的梭状芽孢杆菌亚群XIVa和更高丰度的梭状芽孢杆菌XVIII,三 结果,二 材料与方法,一 前言,四 结论,IL-10KO 和 OPN/IL-10 DKO小鼠结肠组织CD11b 基因表达,刺激物刺激WT、OPN KO、 IL-10 KO和OPN/IL-10 DKO
14、小鼠产生BMDMs细胞因子数量,IL-10 KO和OPN/IL-10 DKO 小鼠 LPMCs中NOS2, TNF-, and IL-12p40基因的表达,OPN能影响巨噬细胞的活动,三 结果,二 材料与方法,一 前言,四 结论,WT、OPN KO、 IL-10 KO和OPN/IL-10 DKO小鼠在E. Coli 荧光共轭粒子作用后 TEPMs 荧光强度的变化情况,OPN KO小鼠在E. Coli 荧光共轭粒子作用TEPMs荧光强度的变化情况,OPN能影响巨噬细胞的吞噬功能,三 结果,二 材料与方法,一 前言,四 结论,3周龄IL-10 KO和OPN/IL-10 DKO小鼠肠系膜淋巴结细菌种类,相比IL-10 KO小鼠，OPN/IL-10 DKO小鼠肠系膜淋巴结细菌种类更多,结论,四 结论,三 结果,二 材料与方法,一 前言,OPN缺失会加快IBD小鼠自发性结肠炎的发病。OPN的合成集中在结肠上皮细胞，并对炎症信号迅速响应。 OPN 缺失会影响体内肠道菌群，sOPN和iOPN都能够控制巨噬细胞吞噬功能。 自发性结肠炎时OPN对肠道细菌的具体作用和对体内巨噬细胞吞噬功能的影响有待进一步研究，它会对OPN在结肠炎各阶段作用和IBD的病理生理学研究提供新的认识。,谢谢！,作者：#,#,
