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1、编制本教材的任务是给车间员工进行培训。 且已经有对应的模版了，模板中所涉及的大纲你到教材中都需要体现出来，如：目的、原理、规范操作（送样、取样、看分析结果等方面的）、操作存在的风险（取样操作如何取出具有代表性的样品等方面）。总体而言，你到这份讲义的侧重点应该在如何规范取样、送样、看分析结果。这些的前天是需要对GC、LC有相关的了解。可以结合一些图片说明。,色谱基础知识简介,气相色谱 高效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC） 质谱基础知识,1.1气相色谱特点,气相色谱法是指用气体作为流动相的色谱法。由于样品在气相中传递速度快，因此
2、样品组分在流动相和固定相之间可以瞬间地达到平衡。另外加上可选作固定相的物质很多，因此气相色谱法是一个分析速度快和分离效率高的分离分析方法。近年来采用高灵敏选择性检测器，使得它又具有分析灵敏度高、应用范围广等优点。,1.2气相色谱原理,GC主要是利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。待分析样品在汽化室汽化后被惰性气体（即载气，也叫流动相）带入色谱柱，柱内含有液体或固体流动相，由于样品中各组分的沸点、极性或吸附性能不同，每种组分都倾向于在流动相和固定相之间形成分配或吸附平衡。但由于载气是流动的，这种平衡实际上很难建立起来。也正是由于载气的流动，使样品组分在运动中进行反复多次的分配
3、或吸附/解吸附，结果是在载气中浓度大的组分先流出色谱柱，而在固定相中分配浓度大的组分后流出。当组分流出色谱柱后，立即进入检测器。检测器能够将样品组分的与否转变为电信号，而电信号的大小与被测组分的量或浓度成正比。当将这些信号放大并记录下来时，就是气相色谱图了。,1.3气相色谱仪的基本结构,图示,钢瓶He,N2,数据处理,1. 进样口温度考虑样品中各组分的沸点，设定温度使样品瞬间汽化。2.色谱柱温度考虑样品中各组分的沸点，及希望的分析周期，宽沸程样品应使用程序升温。3.检测器温度防止检测器污染，一般比色谱柱温度高20-30。根据炭数确定分析条件,1.4进样口、色谱柱、检测器的温度设定,1.5气相色
4、谱仪的流动相-载气,氦气（纯度99.99%以上） 氮气（纯度99.99%以上） 氩气（纯度99.99%以上）特殊分析使用 氢气（纯度99.99%以上）注意安全,1.6色谱术语,1）基线：在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线称为基线。基线在稳定的条件下应是一条水平的直线。它的平直与否可反应出实验条件的稳定情况。 2）峰高（h）和峰面积 ：色谱峰顶点与基线的距离叫峰高。色谱峰与峰底基线所围成区域的面积叫峰面积。 3）保留值a. 死时间(t0) ：不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。由于该物质不与固定相作用，因此，其流速与流动相的流速相近
5、。据 t0 可求出流动相平均流速,1.7.1 数据可靠性判断,良好的峰面积重现性，一般CV%在0.53% （变异系数（什么叫变异系数）：标准差与均值的比率) 工作曲线具有良好的线性 相关性要在三个9以上。 峰形正常，避免拖尾峰和前沿峰 (柱选择恰当、衬管无污染、温度及流量设定) 色谱峰分离良好(分离度(什么叫分离度)1.5),1.7.2 计算方法-峰处理参数,峰处理参数(半峰宽, 斜率, 漂移, 变参时间等) 半峰宽：设为最窄峰的半高宽，单位：秒 控制斜率测试时间（对于这些现场人员不能理解的专业俗语可以不提或使用通俗易懂的语言进行描述）：10半峰宽推荐值：填充柱5 s 毛细柱 23 s 斜率：
6、10倍半峰宽内所有信号的总和判断峰起点滤除低平噪声（如蛇行等）斜率值确定：一般采用斜率测试值，也可根据实际需要手动输入。漂移：判断相邻峰的积分方式设定值为0时，工作站将自动判断如漂移值与基线至峰谷连线较接近时，积分可能不稳定，导致面 积值变化较大，需加以注意。,1.8 总结-气相色谱分析步骤,开机：连好流路，先开载气、氢气、空气，再开打开GC仪器，再打开计算机 设定流量、温度、检测器参数 用默认处理参数进行样品分析 根据图谱调整分析条件，再分析样品，直至得到理想谱图 确定定量方法（内标、外标、面积归一等） 选择校正点数，编辑ID表（输入组分的保留时间和标样浓度） 选择校正次数（每浓度取几次均值
7、） 选择曲线计算方式（直线、最小二乘或折线） 按从低浓度到高浓度的顺序，分析完所有标样，即完成曲线制作 进行未知样分析，每次分析结束，自动计算定量结果 分析完了，关机，系统降温后，关闭工作站窗口。关载气。关闭GC主机电源。,一、概述气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。所以，HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱。通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。其实，有些液相色谱方法并不能简单地归于这四类,2.1高效液相色谱法,2.2高效
8、液相色谱仪,2.3液相色谱简易流程图,输液泵,进样器,色谱柱,柱温箱,检测器,溶剂,数据处理,废液,2.4基本分析方法高效液相色谱法在医药领域中的应用非常广泛，它能用于化学合成药物的含量测定和杂质限量分析，用于中草药和中成药的定性鉴别和有效成分或指标成分的测定，也用于制剂分析，还用于药物代谢和动力学研究。此外，HPLC还广泛用于天然药物有效成份的分离制备和纯化。这些方法主要分为：定性分析、定量分析、杂质分析。对于任何方法都必须进行验证和评价。,一、 HPLC分析方法的参数及验证1.专一性专一性（specificity）又称为特效性，是指在可能存在诸多干扰组分时方法明确确定被分析组分的能力，分析
9、含有和不含有干扰组分的样品，比较分析结果，其差异即是方法偏差（bias）。如果结果没有差异，则说明方法具有专一性。 HPLC方法的专一性可以通过检查色谱峰纯度来验证。采用多波长紫外检测器时，同时在两个波长下检测色谱峰，如果测得该峰在两波长之处的吸收之,比值恒定不变，则该峰为纯组分色谱峰。2.准确度分析方法的准确度（accuracy）表示测得值与真值或认可的参考值之间的一致程度。此外，真实性（trueness）表示一组测量值的平均值与真实值间的差异，偏差（bias）表示多组测量值的平均值与真实值间的差异,偏差是由系统误差引起的。通常用回收率实验来验证准确度。方法回收率实验应包括整个实验过程，实际
10、上是以相同的方法配置分析对照品系列和测试样,品，以对照品结果绘制标准（工作）曲线，在以此曲线确定样品的浓度。再在已知浓度的样品中加入一定量的对照品，检测其含量。测得值与已知值之差除以加入值再乘以%即为回收率。回收率一般在1005%。3.精密度分析方法的精密度（precision）表示在规定条件下对同一均匀样品多次测得的一组测得值之间的一致程度。精密度的表示方法有标准偏差、方差，更多的是相对标准,偏差（RSD）。精密度可分为重复性（repeatability）、中间精密度(intermediate precision)和再现性（reproducibility），后两者统称为再现性。重复性表示在相
11、同条件下，短时间间隔内的一致程度，如日内精密度（intra-day precision）和批内精密度(intra-assay 或intra-run precision)；中间精密度表示同一实验室内不同日期（intra-day）、不同实验批（intra-assay）、不同分析者、不同仪器间的一致程度。再现性是不同实验室间的,一致程度。在HPLC分析中，如果只用对照品（或样品）溶液重复进样测定精密度，这只表示色谱系统的精密度。而方法的精密度的验证应该对均一的真实（QC）样品进行包括样品处理在内的全过程操作,用接近最低、中间和最高浓度的三个样品浓度进行随机分析。日间精密度还应该连续测定8天，每个样品
12、每天至少测定2次。,4.检测限和定量限在样品中能检测出的被测组分的最低浓度（量）称为检测限（limit of detection,LOD），对其测定的准确度和精密度没有确定的要求。 能以适当准确度和精密度定量测定的样品中组分的最低浓度（量）称为定量限（limit of quantitation,LOQ）。这对低含量的组分的测定如杂质含量的定量测定和体内代谢物的测定十分重要。在定量分析中，定量限比检测限更重要。,二、定性分析方法定性分析及鉴别试验可以分为色谱鉴别法和非色谱鉴别法，后者又可分为化学鉴别法和光谱鉴别法。 1.色谱鉴别法色谱鉴别法是利用色谱定性参数保留时间（或保留体积）对组分进行定性分
13、析，其原理是同一物质在相同色谱条件下保留时间相同。此法只适用于已知范围的未知物，如合成药物的前体或药物的可能代谢产物等。,常常采用已知物对照法，即往样品中加入某一纯物质（对照品），混匀进样。对比加入前后的色谱图，若加入后某峰相对增高，则该组分与对照品为同一物质。2.化学鉴别法化学鉴别法是利用专属性化学反应对分离后收集的组分进行定性分析。此法只能鉴别组分属于哪一类化合物。通常是收集色谱馏分，再与官能团分类试剂反应。有关官能团鉴别试剂可查阅有关文献。,3.光谱鉴别法3.1. 两谱联用法：当相邻组分的分离度足够大时，以制备HPLC获得纯组分，而后用红外光谱、质谱或核磁共振等分析手段进行定性鉴别。3.
14、2. 两谱联用仪：将高效液相色谱仪与光谱仪用界面连成一个整体仪器，实现在线检测，称为两谱联用仪。两谱联用仪能同时给出样品的色谱图和每个组分的光谱图，获得定性、定量分析信息。因此，高效液相色谱-光谱联用仪是当今最重要的分析鉴别方法。,三、定量分析方法HPLC定量分析的参数是色谱峰高和峰面积，定量依据是样品中组分的量（或浓度）与峰高或峰面积成正比。常用的定量方法有外标法、内标法。1.外标法用与待测组分同质的标准品作对照品，以对照品的量对比求算试样含量的方法称为外标法。外标法分为外标工作曲线法、外标一点法和外标两点法等。只要待测组分出峰、无干扰、保留时间适宜，即可用外标法进行定,量分析。但要求进样量
15、必须准确，否则定量误差大。 2.内标法选择适宜的物质作内标物，以待测组分和内标物的峰高比或峰面积比求算试样含量的方法称为内标法。内标法的关键是选择合适的内标物。内标物应该是样品中不含有的物质，纯度要高，与待测组分有相似的理化性质，保留时间与待测组分相近，与样品中各组分能完全分离且不与样品反应。 也分为工作曲线法、内标一点法（内标对比法）。,3.1质谱法的基本原理,一、概述 质谱分析法是在高真空系统中测定样品的分子离子及碎片离子质量，以确定样品相对分子质量及分子结构的方法。 化合物分子受到电子流冲击后，形成的带正电荷分子离子及碎片离子，按照其质量m和电荷z的比值m/z（质荷比）大小依次排列而被记
16、录下来的图谱，称为质谱。,3.2质谱分析特点：,应用范围广； 灵敏度高，样品用量少； 分析速度快，并可实现多组分同时测定； 与其它仪器相比，仪器结构复杂，价格昂贵，使用及维修比较困难； 对样品有破坏性，无法回收。,3.3质谱法的产生机理及基本过程,产生机理质谱法是将样品置于高真空中（10-3 Pa），并受到高速电子流或强电场等作用，失去外层电子而生成分子离子，或化学键断裂生成各种碎片离子，然后将分子离子和碎片离子引入到一个强的正电场中，使之加速，加速电位通常用到68kV，此时可认为各种带正电荷的离子都有近似相同的动能。,但是不同质荷比（m/z）的离子具有不同的速度，利用离子不同质荷比及其速度差异，质量分析器可以将其分离，然后由检测器测量其强度，记录后得到一张以质荷比为横坐标，以相对强度为纵坐标的质谱图。,3.4质谱分析的四个过程,通过合适的进样装置将样品引入并进行气化； 气化后的样品引入到离子源进行电离离子化过程； 电离后的离子经过适当的加速后进入质量分析器，按不同的质荷比（m/z）进行分离； 经检测、记录，获得一张谱图。,
