一、λ噬菌体的分子生物学,第三节λ噬菌体载体,λ噬菌体的生活史,λ噬菌体基因大致分为4个区：结构区A～ J19个基因，编码头、 尾部蛋白质为结构区,重组区 att（attachment）、int（intagrate）及xis（excission），调控区启动子、终止子和NuI基因， O-R 为裂解区1 噬菌体发育调节 ①吸附 ②立即早期转录 ③ 延迟早期转录 ④溶源和裂解的感染分化 ⑤进入裂解生长 ⑥溶源化 噬菌体的可取代区 J 基因与 Cro 基因之间的 DNA 被 ga1 基因或 bio 基因替换后，不影响 λ 噬菌体裂解生长这个区段约占λ噬菌体 DNA 的 1/3 ，主要包含控制λ噬菌体进入溶源状态的调节基因和功能基因,2 λ噬菌体载体的选择标记 2.1 基因组大小重组λ噬菌体的基因组 DNA 太大或太小会影响其存活能力外源 DNA 片段的大小将在 9-23kb 范围内 2.2 lacZ 基因 lacZ 基因也可用于 λ 噬菌体载体，通过插入或替换载体中的 β-半乳糖苷酶基因片段，在 IPTG/X-gal 平板上可通过噬菌斑的颜色，筛选重组噬菌体,λ噬菌体载体的选择标记,2.3 基因 cⅠ 失活 基因 cⅠ 是 λ 噬菌体的抑制基因，全面抑制并阻断基因的表达 。
如果外源 DNA 片段插入基因 cⅠ 中，将高频率地使 E.coli 进入裂解生长状态 2.4 Spi 筛选 通过λ噬菌体载体 DNA 上的 red 和 / 或 gam 基因的缺失或替换，可在 P2 噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组λ噬菌体3.代表性λ噬菌体载体 3.1 插入型载体 通过特定的酶切位点允许外源 DNA 片段插入的载体称为插入型载体由于 λ 噬菌体对所包装的 DNA 有大小的限制，因此一般插入型载体设计为可插入 6kb 外源 DNA 片段，最大 11kb λgt10载体,大小为 43340bp ，是经典的 噬菌体载体，主要用作 cDNA 克隆，允许的插入片段大小为 0-6kb gt11 载体大小为 43.7kb ，是一个常用的载体gt11 载体允许插入的 DNA 片段大小为 0～7.2kb 它用于构建 cDNA 文库、基因组文库和表达融合蛋白该载体最大的特点是在最左侧可替代区置换了一段 lac5 基因，可编码 -半乳糖苷酶，在 IPTG/X-gal 平板上形成兰色噬菌斑 lac5 基因编码区终止密码子之前有一个 EcoRⅠ 位点（53bp 上游），可用于外源 DNA 片段的插入。
筛选时，在 lac- 宿主菌中非重组噬菌斑为兰色当外源 DNA 片段与 lacZ 的阅读框相吻合时，可表达出融合蛋白，可用免疫学方法筛选阳性重组子GEM-2/4 GEM-2 和 GEM-4都是由 gt10 改造而来，也是 cDNA 克隆载体 ZAPⅡ ZAPⅡ 整体上与 gt11 相似，不同的是在基因 J 和 att 位点之间用 pBluescript SK 质粒片段取代了相应的 噬菌体片段，允许插入 0-10kb 的外源片段因此，该载体具备了 pBluescript SK 质粒的一些特性，如 -互补以及可通过启动子合成 RNA 探针 Excell Excell 大小为 45.5kb ，与 ZAPⅡ 相似不同的是，在该载体中装载了 pExCell 质粒载体片段（4190bp）该载体允许外源 DNA 插入的大小为 0-6kb ，主要用于 cDNA 克隆 pExCell 与 pBluescript 载体相似，除了多克隆位点不同外，插入了一段来自 噬菌体的片段该片段含有 噬菌体整合到大肠杆菌染色体所必须的整合位点 att 3.2 置换型载体允许外源 DNA 片段替换非必须 DNA 片段的载体，称为置换型载体（replacement vectors）。
一般情况下，置换型载体克隆外源片段的大小范围是 9-23kb ，故而该载体主要用来构建基因组文库EMBL3 和 EMBL4 这两个载体大小为 43kb ，其左臂、右臂和填充片段的大小分别为 20kb、 9kb 和 14kb 从提高克隆效率角度来看，它们克隆 DNA 片段的大小为 9-23kb 在填充片段中带有 red 和 gam 基因，当外源片段替换填充片段后，重组体将变成 red-gam- ，同时载体上含有 chiC 位点，因此可用 P2 噬菌体的溶源性大肠杆菌进行 Spi 筛选重组体,2001、DASH 和 FIX 载体 2001、DASH 和 FIX 载体的结构和大小与 EMBL3 载体相似，主要不同在于多克隆位点的酶切位点数量、排列和种类不同 DASH 和 FIX 载体的特点在于，在其多克隆位点中含有 T7 噬菌体启动子和 T3 噬菌体的启动子这些噬菌体的启动子可在体外转录合成RNA，用作染色体步查（chromosome walking）的探针GEM-11 载体 GEM-11 载体的左右臂来自 EMBL3 载体，填充片段来自 2001 ，是一个多功能置换载体。
其多克隆位点与上述置换载体稍有不同，但保留 XhoⅠ 位点，同时在填充片段的最末端各有一个识别 8 个核苷酸序列的稀有酶切位点 SfiⅠ 在获得阳性克隆后，通过 SfiⅠ 酶切位点可将外源片段从载体中切割下来进行亚克隆，而在相当大程度上不会切割外源片段还有一个区别是，在右边的多克隆位点中有 SP6 噬菌体的启动子，而不是 T3 噬菌体的启动子,二λ噬菌体载体的克隆原理及步骤 主要用于克隆DNA片段，构建cDNA文库和基因组文库并丛中筛选目的基因原理同质粒载体，只是相对分子量太大不能通过转化法直接进入大肠杆菌，要通过包装DNA形成噬菌体颗粒注射到宿主菌中步骤；①通过裂解增殖载体 ② 载体与外源DNA的酶切③外源DNA与载体连接④重组噬菌体的体外包装⑤包装噬菌体颗粒的感染 ⑥ 筛选,λ噬菌体从溶原转为裂解是一种可诱导过程 诱导的因素可能很多，实验室常用的是热诱导:分离得到某些λ噬菌体，在低温时（30℃）建立溶原，用高温（420C）则出现裂解这些λ噬菌体的cl基因是温度敏感突变型的，称为c1tsλcl ts1857，可作为组件插入质粒DNA内目的基因插在λcl ts857下游，重组体的目的基因在42℃表达，30℃不表达。
这种方法称为热诱导表达，使用的是温敏开关λCIts857,,,,,,ori,目的基因,,PL,,阻遏蛋白,,,,30℃下培养：,,,,,,目的基因,,,阻遏蛋白,,42℃下培养：,,失活,,,λPL和 λPR,λPL和PR 是λ噬菌体上2个主要的启动子，都是启动能力相当强的转录构件把λ启动子连同其附属成分，置换了pBR322的tetr基因，成为以λ启动子为组件的质粒1）粘粒（cosmid）能容纳大片段（45kb）的小分子（4kb～ 6kb）载体组成：质粒复制原点，抗药基因，多克隆位点，已连接入的λcos位点构建基因文库的λ载体,,（2）λDNA的体外包装是提高λ噬菌体转染效率的有效方法在A蛋白（有终止复制功能），E蛋白（是包装蛋白），D蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重组体DNA转入头部第四节、单链丝状噬菌体载体,方便的制备单链DNA，用于定点诱变、DNA核苷酸序列测定和制备单链DNA探针一、M13噬菌体的生物学 1 组成和结构 M13 噬菌体的基因组为单链 DNA ，由 6407 的碱基组成 基因组 90% 以上的序列可编码蛋白质，共有 11 个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基 ． M13 噬菌体基因组可编码 3 类蛋白质，包括复制蛋白（基因 Ⅱ，Ⅴ 和 Ⅹ），形态发生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ 和 Ⅺ），结构蛋白（基因 Ⅲ 、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ 和 Ⅸ）。
所有结构蛋白在形态发生之前都插入在宿主细胞的质膜中基因组 DNA 为正链，按基因 Ⅱ 至基因 Ⅳ 方向合成，与噬菌体的 mRNA 序列同义2 M13 噬菌体的增殖吸附 感染 复制 组装 3 M13噬菌体载体单链 DNA 的酶切和连接是比较困难的，因此 M13 噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的 RF DNARF DNA 很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞 4 载体的插入位点 M13 噬菌体基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源 DNA（基因 Ⅱ/Ⅳ 和基因 Ⅷ/Ⅲ 之间） 基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之间的 508bp 间隔区是主要的外源片段插入位点在基因 Ⅷ 和基因 Ⅲ 之间的小间隔区也可用来插入外源片段，但是在操作过程中，需要获得感染细胞的菌落进行影印筛选，比利用可见的噬菌斑方法更慢更麻烦基因 Ⅹ 也可用来克隆外源片段,,,,5 M13 噬菌体载体组成 现在所使用的 M13 噬菌体载体是 Messing 及其同事建立的 mp 系列载体，以基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之间的区域作为外源 DNA 插入区 mp 载体系列都是从同一个重组 M13 噬菌体 （M13mpl） 改造而来的。
在 M13mpl 载体中，间隔区内的 HaeⅢ 位点插入了一小段大肠杆菌 DNA ，引入 α 互补筛选 6 M13mpl8 和 M13mpl9这两个载体含有 13 个不同的酶切位点，可供插入由多种各不相同的限制酶切割而成的 DNA 片段 两种载体只是在 lacZ 区内不对称的多克隆区的方向上有所不同 ３．M13噬菌体载体的宿主菌由于 M13 噬菌体通过 F 质粒编码的性纤毛进入宿主细胞内，故只能用雄性细菌来增殖病毒 Messing 及其同事已经构建了许多携带 F‘ 质粒并便于 M13 载体进行基因操作的多种大肠杆菌菌株４．丝状噬菌体载体克隆中经常遇到的问题① 外源DNA区段的部分丢失 ②外源DNA总是以单方向插入,二 噬菌粒 一类由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列 ，是集质粒和丝状噬菌体的有利特征于一身的载体，具有 ColE1 复制起点及抗生素抗性选择标记的质粒，以及丝状体噬菌体的间隔区pUC118和pUCll9是一对分别由pUC18和pUC19质粒与野生型M13噬菌体的基因间隔区（IG）重组而成的噬菌粒载体除了多克隆位点区的序列取向彼此相反而外，两者的分子结构完全一样。
噬菌粒的特征,① 双链 DNA 既稳定，又高产，具有常规质粒的特征； ② 免去了将外源 DNA 片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一既繁琐又费时的步骤； ③ 由于载体足够小，故可得到长达 10kb 的外源 DNA 区段的单链噬菌粒的主要优点在于它可以产生大段外源 DNA 的适量单链拷贝，又不必担心发生缺失突变，而这些外源 DNA 区段常常由于太大而不能克隆于常规 M13 载体但许多噬菌粒都有一个主要缺点，即辅助噬菌体感染后，有时候单链 DNA 的产量较低且重复性较差M13KO7 辅助噬菌体M13KO7 辅助噬菌体是 M13 的衍生株，大小为 8.7kb M13K07 中突变的基因 Ⅱ 产物与自身携带的噬菌体复制起点的作用尚不如它与克隆于噬菌粒 pUCll8 和 pUCll9 中的病毒复制起点的作用有效，这就使噬菌粒正链 DNA 能够优先合成，以确保在细胞所产生的病毒颗粒中来自噬菌粒的单链 DNA 能够占据优势,。