基因工程的基本操作程序(3)

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1、1,1.2基因工程的基本操作程序,本节学习目标：1、叙述基因工程的基本操作程序；2、叙述目的基因的获取方法：从基因文库获取；反转录获取；3、解释基因文库、基因组文库、部分基因文库的区别与联系。 4、叙述PCR技术的原理、条件及操作过程；,第一课时,2,温故 ：,1.基因工程的概念(1)操作环境： (2)优点：(3)操作水平： (4)原理：(5)本质：,体外,定向改造生物性状。,分子水平,基因重组,甲(供体提供目的基因) 乙(受体表达目的基因),即基因未变、合成蛋白质未变,只是合成场所的转移。,3,2、限制性核酸内切酶,温故 ：,4,温故 ：,DNA连接酶,5,目的基因的获取,基因表达载体的构建

2、,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,基因工程的基本操作分为那几个步骤？P8,温故 ：,6,浏览P8-15并思考：1.什么是目的基因？为何要获取目的基因？2.表达载体的组成如何？为什么要有“表达载体的构建”这一步？ 3.为何要有“目的基因导入受体细胞”这一步？ 4.为何要有“目的基因的检测与鉴定”这一步？,7,聚焦一：目的基因的获取方法,如果实验室有现成的人胰岛素mRNA，请用所学知识设计获得人胰岛素基因（cDNA）的过程？需要什么酶？,反转录法,8,聚焦一：目的基因的获取方法,延伸思考：从哪些细胞中能提取到人胰岛素mRNA？,9,补：真核细胞的基因结构,能够编码蛋白质的序列；,不编

3、码蛋白质的序列，相应的mRNA片段将被切除。,内含子：,外显子：,10,通过反转录法得到的人胰岛素基因与人体内的胰岛素基因完全相同吗？,cDNA不含非编码区的启动子、终止子 、编码区的内含子,11,原核细胞不具有剪切、拼接mRNA的能力，所以真核细胞的基因不能在原核细胞的受体细胞中正确表达,补：真核细胞的基因结构,12,聚焦一：目的基因的获取方法,能否依据人胰岛素氨基酸序列推导出基因中脱氧核苷酸序列，再通过化学方法合成人胰岛素基因？,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,该目的基因与人的胰岛素基因序列是否相同？,13,1）反转录法：,蛋

4、白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,聚焦一：目的基因的获取方法,14,（ 2009宁夏 12分）多数真核生物基因中编码蛋白质的序列被一些不编码蛋白质的序列隔开，每一个不编码蛋白质的序列称为一个内含子。这类基因经转录、加工形成的mRNA中只含有编码蛋白质的序列。某同学为检测某基因中是否存在内含子，进行了下面的实验： 步骤：获取该基因的双链DNA片段及其mRNA； 步骤：加热DNA双链使之成为单链，并与步骤所获得的mRNA按照碱基配对原则形成双链分子； 步骤：制片、染色、电镜观察，可观察到图中结果。

5、 请回答：,（1）图中凸环形成的原因是 ，说明该基因有 个内含子。,7,DNA中有内含子序列，mRNA中没有其对应序列，变性后形成的DNA单链之一与mRNA形成双链分子时该单链DNA中无法与mRNA配对的序列能形成凸环,挑战你的极限：,15,2009宁夏（12分）多数真核生物基因中编码蛋白质的序列被一些不编码蛋白质的序列隔开，每一个不编码蛋白质的序列称为一个内含子。这类基因经转录、加工形成的mRNA中只含有编码蛋白质的序列。某同学为检测某基因中是否存在内含子，进行了下面的实验： 步骤：获取该基因的双链DNA片段及其mRNA； 步骤：加热DNA双链使之成为单链，并与步骤所获得的mRNA按照碱基配

6、对原则形成双链分子； 步骤：制片、染色、电镜观察，可观察到图中结果。 （2）如果现将步骤所获得的mRNA逆转录得到DNA,单链，然后该DNA单链与步骤中的单链DNA之一按照碱基配对原则形成双链分子，理论上也能观察到凸环，其原因是逆转录得到的DNA单链中不含有 序列。,内含子,16,聚焦一：目的基因的获取方法,3）从基因文库中获取目的基因,精读P9-10，思考：什么是基因文库？基因文库有哪两种类型？有何区别？如何构建基因文库？如何从基因文库中找到所需要的基因？,含有某物种全部或部分基因的DNA片段的菌群。,序列、功能、位置、mRNA 、蛋白质,17,4)利用PCR技术扩增目的基因,聚焦一：目的基

7、因的获取方法,18,聚焦一：目的基因的获取方法,精读P10-11及图1-8，思考：,什么是PCR技术？依据的原理是什么？利用PCR技术扩增目的基因需要准备那些物质条件？为什么必需知道目的基因的部分核苷酸序列，才能利用PCR技术对其扩增？为什么会以指数（ 2n ）方式扩增？据图1-8简述PCR技术扩增基因的过程。,4）利用PCR技术扩增目的基因,19,四种脱氧核苷三磷酸(dNTP),一对引物：,热稳定DNA聚合酶(Taq酶）,模板DNA( 需含有目的基因 ),条件：,缓冲溶液,一对短核苷酸序列，与目的基因的起始段互补,一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物,前提：,聚焦一：目的基

8、因的获取方法,20,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、复性（55-60）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,21,变性,聚焦一：目的基因的获取方法,22,1、说出基因工程的四步基本操作程序 2、叙述反转录法获取目的基因的过程 3、说出基因文库的概念及两种类型 4、叙述PCR技术的原理、条件及过程,课时小结：,23,目标检测：,2、基因工程又叫基因拼接技术。 （1）在该技术中，用人工合成方法获得目的基因的途径

9、之一是：以目的基因转录的_为模板，_成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成_。,mRNA,反转录,双链DNA,1、在基因工程技术中，下列方法与目的基因获得无关的是A.辐射诱变法 B.从基因文库中获取 C.反转录法 D.人工合成法,A,24,3、PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95下使模板DNA变性、解链55下复性（引物与DNA模板链结合）72下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是 A变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现 B复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成

10、 C延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸 DPCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高,C,25,4、下列关于基因工程的说法中，正确的是 A基因工程的设计和施工都是在细胞水平上进行的B目前基因工程所有的目的基因都是从供体细胞中直接分离得到的C只要检测出受体细胞中含有目的基因，那么目的基因一定能成功进行表达D基因工程能使科学家打破物种界限，定向改造生物性状,D,26,5、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸460 个），放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷三磷酸的个数是A540 个 B7560个 C810

11、0 个 D17280 个,C,27,通过对 受体菌 的培养而 储存基因,构建基因文库,28,3、有关基因工程的叙述正确的是( ) A限制酶只在获取目的基因时才用 B重组质粒的形成是在细胞内完成的 C质粒都可以作为运载体 D蛋白质的氨基酸排列顺序可以为合成目的基因提供线索,D,29,1.2基因工程的基本操作程序,第二课时,学习目标：1、叙述基因表达载体的组成及构建过程；2、叙述将目的基因导入受体细胞的方法；3、叙述如何筛选被重组质粒侵入的受体细胞；4、叙述目的基因是否存在及表达的检测与鉴定方法。,30,科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中

12、，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。,资 料:,聚焦二：基因表达载体的构建,作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,31,基因表达载体的组成：,使目的基因在受体细胞中稳定存在、能够表达，并能遗传给下一代，。,聚焦二：基因表达载体的构建,32,聚焦二：基因表达载体的构建,阅读P11并思考：,启动子、终止子、复制原点有何作用？ 标记基因有什么

13、作用？ 基因的运载体、目的基因、启动子、终止子和标记基因 等都是DNA片断，如何将它们连接起来？,33,运载体,目的基因,？种限制酶切,(黏性)末端,(黏性)末端,？酶,重组DNA分子（重组质粒）,有几种重组DNA ？,聚焦二：基因表达载体的构建,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,34,聚焦二：基因表达载体的构建,35,聚焦三：将目的基因导入受体细胞,方法,将目的基因导入 植物细胞,将目的基因导入 动物细胞,将目的基因导入 微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,阅读P12-13，思考：1、何谓“转化”？2、将目的基因导入植物细胞

14、、动物细胞、微生物细胞的方法分别有哪些？,36,1、将目的基因导入植物细胞的方法：读图1-11，思考：1）Ti质粒与T-DNA的化学本质是什么？二者有何关系？2）简述农杆菌转化法的操作过程。,聚焦三：将目的基因导入受体细胞,适用于 双子叶植物 裸子植物,37,适用于 单子叶植物,基因枪法,适用于 被子植物,1、将目的基因导入植物细胞的方法：,聚焦三：将目的基因导入受体细胞,38,提纯基因表达载体 显微注射受精卵,聚焦三：将目的基因导入受体细胞,2、将目的基因导入动物细胞 显微注射法,39,用Ca2+处理细胞感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子,聚焦三：将目的基因导入受

15、体细胞,3、将目的基因导入微生物细胞 （1）原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少。 （2）方法：,40,思考与探究：,利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,聚焦三：将目的基因导入受体细胞,糖蛋白的多糖链需在内质网和高尔基体上加工完成的，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中不可能生产糖蛋白。,41,聚焦三：将目的基因导入受体细胞,如何筛选出被重组质粒侵入的受体细胞。,42,青霉素培养基,青霉素抗性基因,聚焦三：将目的基因导入受体细胞,深度思考：如何筛选出被重组质粒侵入的受体细胞。,43,聚焦三：将目的基因导入受体细胞,深度思考：,培育转基因植物时，受精卵、体细胞是否都能作为受体细胞？培育转基因动物时，受精卵、体细胞是否都能作为受体细胞？,44,聚焦四：目的基因的检测与鉴定,阅读p13-15，思考：1、受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？ 2、目的基因是否稳定的存在于转基因生物并按人们的预期进行表达，需要在那些水平上进行检测？,45,聚焦四：目的基因的检测与鉴定,分子水平 检测,个体水平鉴定,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,