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1、Real Time PCR System 安装培训,Sequence Detection Systems Product Line Service Department, China,1、PCR 原理概述 2、Real Time PCR 化学原理 3、Real Time PCR 数学原理 4、Real Time PCR 数据分析 5、Real Time PCR 技术应用 6、技术支持,Polymerase Chain Reaction 原理概述,PCR是如何实现的?,传统PCR具有以下基本要素dsDNA（DNA模版）, Primers（引物）, dNTPs（核苷酸）, PCR buffer（缓
2、冲液）, Taq polymerase（DNA聚合酶）等,TGCAAACAGATTAGACATAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCA ACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGTCTAATCTATCTGAATCTACAAACCGT,PCR是如何实现的?,在控温模块（Temperature Block）上实现循环反应Denaturating of template（模板变性）Annealing of oligos（引物退火）Extension of primers to make new products （序列延伸）,PCR是如何实现的?,所需的片断会
3、逐渐增多,5ACGTTTGTCTAATCTGTATCTA 3TGCAAACAGATTAGACATAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCA3ACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGTCTAATCTATCTGAATCTACAAACCGT ATTAGATGACTTAGATGTTTGGCA,5ACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGTCTAATCTATCTGAATCTACAAACCGT 3TGCAAACAGATTAGACATAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCA5ACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGT
4、CTAATCTATCTGAATCTACAAACCGT 3TGCAAACAGATTAGACATAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCA,PCR的数学基础,Xn = X0 ( 1 + Ex )n n = PCR循环数 Ex = PCR扩增效率 X0 = 起始目标DNA分子数 Xn = 第n个循环后的目标DNA分子数 理想情况下，Ex = 100%，Xn = X0 2n,PCR的三个阶段,指数/对数扩增期 Xn = X0 2n（理想状态） Ex不变 线性扩增期 Ex逐渐变小 平台期 Ex = 0,指数/对数扩增,线性扩增,平台期,Real Time PCR 化学原理,什
5、么是Real Time PCR?,实时监控特定核酸目标序列PCR扩增的技术 Technology to monitor, in real-time, the PCR amplification of specific nucleic acid targets,Real Time PCR是如何实现的?,在PCR混合液中含有荧光物质（fluorescence）,Real Time PCR是如何实现的?,随着扩增的进行, 荧光信号会随着PCR产物的增加而增加,PCR,PCR,PCR product,Real Time PCR是如何实现的?,Real Time PCR仪包括Thermal Block控
6、温模块, Light Resource 激发光源, Light Splitter分光系统, 和 CCD Camera信号采集四大部分,Real Time PCR是如何实现的?,Real-time PCR仪会纪录每个循环的荧光信号变化,Cycle 3 Filter A Sample 1 Bin N,Real Time PCR是如何实现的?,最后，Real Time软件会对采集到的数据进行分析,Real Time PCR化学原理,荧光信号是怎样随着PCR产物的增加而增加的呢？,SYBR Green I,TaqMan,TaqMan 化学原理 (又称 5-Nuclease ),TaqMan 化学原理,
7、TaqMan 中会使用到两段短片段序列，称为双向特异引物,TaqMan 化学原理,TaqMan 中第三段短片段序列称为探针，结合到序列中间,TaqMan 化学原理,探针标记两种 染料分子,报告染料 Reporter dye,淬灭染料 Quencher dye,TaqMan 化学原理,完整的探针,报告染料 Reporter dye,淬灭染料 Quencher dye,TaqMan 化学原理,完整的探针,能量,报告染料Reporter没有荧光信号,TaqMan 化学原理,如果探针断裂了,TaqMan 放映开始,TaqMan 化学原理,Denaturating of template（模板变性）,T
8、aqMan 化学原理,Annealing of oligos（引物退火）,TaqMan 化学原理,Taq酶 登场,TaqMan 化学原理,找到引物序列,TaqMan 化学原理,Extension of primers（序列延伸）,TaqMan 化学原理,Extension of primers（序列延伸）,TaqMan 化学原理,Extension of primers（序列延伸）,TaqMan 化学原理,Extension of primers（序列延伸）,TaqMan 化学原理,Extension of primers（序列延伸）,TaqMan 化学原理,Extension of prim
9、ers（序列延伸）,?,TaqMan 化学原理,Taq酶 很特别,具有核酸外切酶活性， 可以“吃掉”结合到模板上的DNA片段,TaqMan 化学原理,Taq酶 开始降解探针,TaqMan 化学原理,Taq酶 开始降解探针,TaqMan 化学原理,Taq酶 开始降解探针,TaqMan 化学原理,Taq酶 开始降解探针,TaqMan 化学原理,Taq酶 开始降解探针,TaqMan 化学原理,Taq酶 开始降解探针,TaqMan 化学原理,Taq酶 开始降解探针,TaqMan 化学原理,Taq酶 开始降解探针,TaqMan 化学原理,Taq酶 开始降解探针,TaqMan 化学原理,Taq酶 开始降解
10、探针,TaqMan 化学原理,Taq酶 开始降解探针,TaqMan 化学原理,Taq酶 开始降解探针,TaqMan 化学原理,Taq酶 开始降解探针,TaqMan 化学原理,Taq酶 开始降解探针,TaqMan 化学原理,Taq酶 开始降解探针,TaqMan 化学原理,Taq酶 开始降解探针,TaqMan 化学原理,Taq酶 开始降解探针,嗝!,TaqMan 化学原理,新的序列，新的信号！,SYBR Green I 化学原理,SYBR Green I 化学原理,SYBR Green I 化学原理,SYBR Green I 化学原理,新的序列，新的信号！,SYBR Green I 化学原理,非特
11、异结合任意 双链DNA,SYBR Green I 化学原理,使用 Melt curve (Dissociation Curve) 检查PCR反应产物的特异性,Temperature ,Fluorescence ,原始图谱,SYBR Green I 化学原理,使用 Melt curve (Dissociation Curve) 检查PCR反应产物的特异性,Temperature ,Fluorescence ,导数图谱,Real Time PCR化学原理,每个循环之后 理论上，反应管里的目标片断数会加倍。 荧光信号相应成比例增长。,Real Time PCR化学原理,TaqMan, 还是 . .
12、. SYBR Green I ?,优点 更高的特异性 不会有引物二聚体干扰 支持多重荧光实验设计 实验方法易于优化缺点 价格稍贵,优点 价格便宜 大部分基因以及少量样品均适用缺点 特异性稍差 必须要做 Melt curves 不支持多重荧光设计 实验方法通常需要优化,Real Time PCR 数学原理,Real Time PCR理想状态,Xn = X0 2n,Real Time PCR实际状态,线形图谱Linear 半对数图谱Log,Real Time PCR常用术语,Baseline 基线,定义背景区域: cycle-to-cycle 的范围,Real Time PCR常用术语,Threshold 阈值,在扩增曲线上，可以调节的一条水平线 告诉软件到哪里获得分析数据,Threshold,Real Time PCR常用术语,Cycle threshold （又称 Ct值）,扩增曲线与阈值的焦点，对应的带小数点的循环数,Real Time PCR基本原理,Xn = X01 2Ct1 = X02 2Ct2,lgXn,Real Time PCR基本原理,X01 / X02 = 2 - Ct,Real Time PCR 数据分析,Baseline 基线的设置,
