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1、化学药物结构确证研究的技术要求与案例分析,王玉成 中国医学科学院 医药生物技术研究所,目录,(一) 结构确证研究的一般原则和要求 (二) 对不同类别药品结构确证的要求 (三) 对特殊化学结构药品结构确证的要求 (四) 各项波谱和测试的技术要求(案例),1. 结构确证研究的主要对象2. 结构确证研究的基本方法3. 结构确证研究的主要内容4. 结构确证研究的一般要求,(一) 结构确证研究的一般原则 和要求,1. 结构确证研究的主要对象,经化学全合成或半合成、微生物发酵以及从动、植物中提取的原料药,包括新药、进口药和已有国家标准的药品.,按来源：化学合成、半合成、天然产物中提取、发酵等; 按组分：单
2、一组分、多组分混合物; 按分子量：小分子化合物、大分子化合物; 按结构特点：成盐化合物和非成盐化合物、手性化合物和非手性化合物、含结晶水/溶剂和不含结晶水/溶剂等;,2.结构确证研究的基本方法, 化学方法：理化分析、元素分析、化学关联等 物理方法：波谱方法、衍射技术a. 射频波、微波与物质的相互作用：核磁共振、电子顺磁共振等 (ESP根据谱图中吸收峰的位置、谱线的积分强度、谱线的宽度及超精细结构等信息可以鉴定自由基和过滤金属离子等顺磁粒子的结构状态，检测它们的浓度（可检测到10-14摩/升）。)b. 红外、可见、紫外光与物质的相互作用：红外光谱、紫外光谱、拉曼光谱等c. X射线与物质的相互作用
3、：X射线衍射等d. 电子与物质的相互作用：质谱、电镜等e. 其他：热分析、原子吸收、原子发射等,3.结构确证研究的主要内容, 骨架（平面）结构：分子中各原子之间的连接顺序和方式; 构型：分子中各原子之间的空间相对位置; 结晶水/结晶溶剂：与水、有机溶剂通过氢键等结合; 晶型：分子（或原子）在晶体中的排列方式;,骨架（平面）结构 例：氟吗西尼,骨架（平面）结构的研究方法:,a. 单晶X射线衍射;b. 常规方法，如元素分析（或高分辨质谱）、UV、IR、NMR（包括二维谱）、MS等组合;应根据化合物骨架结构的特点及其复杂程度、有无对照品及参考文献，合理选用测试项目。,构 型： 几何构型: 双键、环状
4、化合物，常用顺反（cistrans）或ZE表示 例：西尼地平 （）-3-（2-甲氧基乙基）-5-3-苯基-2（E）-丙烯基-2,6-二甲基-4-（3-硝基苯基）-1,4-二氢- 3,5-吡啶二甲酸酯,例：拉米夫定 (2R-顺式)-4-氨基-1-(2-羟甲基-1，3-氧硫杂环戊-5-基)-1H-嘧啶-2-酮,几何构型的研究：,理化性质差别明显a. 理化常数，例如熔点等;b. 氢谱、碳谱;c. 红外光谱、紫外光谱等;,光学异构：由于分子的不对称性引起，常用D- L或R-S表示。 例：那格列奈 （）N-（反-4-异丙基环基甲酰基）-D-苯丙氨酸,例：前列腺素E1（1R，2R，3R）-3-羟基-2-（
5、E）-（3S）-3-羟基-1-辛烯基-5-氧代环戊烷庚酸,光学异构的研究：,a. 比旋度测定b. 手性柱色谱（HPLC、GC）c. 核磁共振（NMR）d. 单晶X射线衍射（SXRD）e. 旋光光谱（ORD）(1. 决定化合物之绝对立体构造。 2. 决定蛋白质2级与3级构造。 )f. 圆二色谱（CD）,g. 其他方法对照品法根据对照品的构型推定化学关联法利用合成工艺分析例如， 左旋西替利嗪的构型确证：手性柱色谱定位（与对照品对比)、 比旋度数据、光学纯度分析,晶型的研究:,晶型 是化合物一个重要特性;对于多晶型药物,因晶格结构不同,某些理化性质(如熔点、溶解度、稳定性)可能不同;而且在不同条件下
6、,同一化合物的各晶型之间可能会发生相互转化。对于难溶性固体口服制剂,其原料药晶型可能影响药物的溶解度、稳定性、药代动力学性质进而可能影响药效。所以对于已有文献报道的多晶型化合物应明确其晶型,晶型的一致性;对于创新药也应注意积累相关研究资料观察有无多晶型现象。,晶型的研究:,a. 粉末X-射线衍射法b. 红外光谱法、拉曼光谱法c. 熔点法d. 热分析e. 光学显微镜法,无对照品和文献报道：考察不同结晶条件下（溶剂、温度、结晶速率等）制备样品的熔点、红外光谱、粉末X射线衍射等; 有对照品:对比自制药物与已上市药物的熔点、红外光谱图、粉末X射线衍射图谱等;有文献报道:对文献资料进行分析，选取能够准确
7、反映产品晶型的测试项目;,结晶水/结晶溶剂的研究:,药物分子通过氢键等和水、有机溶剂结合形成水合物/溶剂化物,含有不同数量结晶水/结晶溶剂的化合物可能具有不同的物理性质,进而可能影响药物的生物利用度,因此对于原料药应明确其所含的结晶水/溶剂的情况。,结晶水/结晶溶剂的研究:,a.元素分析b.热分析c.干燥失重、水分检查d.单晶X-射线衍射,创新药：在干燥失重、水分测定研究的基础上，通过热分析、元素分析等确证样品分子中结晶水/结晶溶剂的数量;已上市的药品：采取合适的分析方法对样品进行分析，以确证其结晶水/结晶溶剂的情况与已上市产品一致;,小结：,在审评过程中专家评价的关注点一般包括:结构确证方案
8、设计的合理性,是否对化合物所有要素进行了考虑;研究内容设置的全面性,所有的结构特征是否已被确证;分析方法选择的正确性,所用方法能否针对性地解决结构问题。研发者在进行结构确证研究时,测试项目的选择要依据化合物结构特点、需要解决的结构问题、各种方法所能解决的结构问题等综合考虑。,4. 结构确证研究的一般要求, 对测试样品和对照样品的要求：,测试样品:a. 精制方法测试样品要采用和原料药制备工艺中相同的精制方法、工艺条件进行精制；对于进行晶型分析、结晶水/结晶溶剂分析时尤其需要注意，因为不同的精制方法和工艺条件可能产生不同的晶型、结晶水/溶剂。b. 纯度要求大于99.0%，杂质含量应小于0.5%；
9、对于手性药物，应增加对对映体、非对映体纯度要求，一般 不低于99.5%。,注意点： 仿制药物：相关物质大于或等于0.1%，要进行结构确证（注意响应因子） 创新药物：除了与仿制药物一样之外，尽可能多的罗列所有可能杂质，要与中间体关联，特别注意手性问题！,对照品:a. 合法来源证明购得的标准品(已有国家标准的药品)市售原料药市售制剂中提取得到的原料药从正规试剂公司购得的试剂等 （有的申报资料中，未选择上市原料药或其他合法对照品，而是采用自己单位精制的产品，这种“自身”对照的数据和图谱对于结构确证没有任何帮助。 ）,b. 精制方法：对于用于晶型、结晶水等信息确证的对照品，不应采用处理后原料药或制剂中
10、提取物作为对照品，因为原料药和制剂在不同溶媒处理后，会对样品真实的晶型和结晶水产生影响，造成误判。c. 纯度检查：对照品的纯度检查：申报资料中应提供对照品的纯度检查结果。一般来说，对照品纯度应不低于精制品纯度，以保证对照品对药物结构确证的支持力度。,对图谱、数据的要求,附图应为原图的复印件或照片; 图谱及图谱上的标记、数据应清晰，并有完整的检测日期、各项参数、测试条件、仪器型号及样品编号等记录。各项检测数据应按规定列表说明，注明其顺序。有对照品的应将测试品和对照品同一波谱的数据在一个表中对比列出。如有可作参照的文献数据，也可列在同一表中。质谱应附离子裂解图。,对杂质的要求,国食药监注 2010
11、 387 号附件： 化学药品CTD格式申报资料撰写要求,3.2.S.3.1 结构和理化性质 （1）结构确证 结合合成路线以及各种结构确证手段对产品的结构进行解析，如可能含有立体结构、结晶水/结晶溶剂或者多晶型问题要详细说明。 提供结构确证用样品的精制方法、纯度、批号，如用到对照品，应说明对照品来源、纯度及批号；提供具体的研究数据和图谱并进行解析。具体要求参见化学药物原料药制备和结构确证研究的技术指导原则。 （2）理化性质 提供详细的理化性质信息，包括：性状(如外观，颜色，物理状态)；熔点或沸点；比旋度，溶解性，吸湿性，溶液pH, 分配系数，解离常数，将用于制剂生产的物理形态（如多晶型、溶剂化物
12、、或水合物），粒度等。,3.2.S.3.2 杂质 以列表的方式列明产品中可能含有的杂质（包括有机杂质，无机杂质，残留溶剂和催化剂），分析杂质的来源（合成原料带入的，生产过程中产生的副产物或者是降解产生的），并提供控制限度。示例如下：,杂质情况分析,对于降解产物可结合加速稳定性和强力降解试验来加以说明；对于最终质量标准中是否进行控制以及控制的限度，应提供依据。 对于已知杂质需提供结构确证资料。,(二) 对不同类别药品结构确证的要求,未知结构的化合物：推论结构 已知结构的化合物：验证结构, 未在国内外上市销售的原料药,按全新化学单体要求：推论结构a.完成必要的各项测试;b.应提供充分的试验图谱和数
13、据;c. 按新化合物要求进行图谱解析和综合解析;如有参考文献资料，可提供作参考。, 已在国外上市销售但尚未在国内销售的原料药或已有国家标准的原料药,按已知化学结构的药物：验证结构可以使用对照品可以参考文献,a. 有合格对照品的化合物：提供测试样品和对照品在完全相同条件和同一仪器上测得的各项图谱和数据，完成所需的各项目测试，若二者完全相同，并对重要的波谱讯号和测试数据进行了正确解析，即可得出二者化学结构一致的结论。,b. 有详细文献数据的化合物：可对结构确证研究的内容、方法提供线索，并为解析提供参考，但是不能作为结构确证研究的充分证据，仍需要进行较为详尽的图谱解析和综合解析。,c. 无对照品和文
14、献数据的化合物：除了目标化合物的结构外，缺乏其他支持性资料，因此原则上应按全新化学单体要求进行全面的研究，提供充分的试验图谱和数据，可结合其它研究工作（例如合成工艺路线的确定）以进一步推论化合物的结构。,(三) 对特殊化学结构药品结构确证的要求,1. 立体异构体药物,立体异构体： 光学异构体 a. 对映异构体 b. 非对映异构体 几何异构体（顺、反异构体）,手性药物-绝对构型和相对构型a. 单一对映体-绝对构型比旋度测定 手性柱色谱 (手性HPLC和GC) 核磁共振 单晶X-衍射 圆二色谱旋光光谱,b. 消旋体-有多个手性中心时要求确定相对构型;c. 立体异构混合物-确定异构体的组成和比例;,
15、“手性药物申报资料及审评要点” (药审中心), 应注意确证产品的立体构型。可根据手性中心的多少、文献数据是否充足、对照品的有无来选择合适的确证的方法，必要时可采用单晶X射线衍射进行确证。 比旋度是必须的检测项目之一，已知的起始原料的构型和化学合成方法的立体选择性也可作为依据之一。,2. 具有多晶型的药物,晶型:是指结晶物质晶格内分子的排列形式。 多晶型物质晶格内部分子间力的差异可能引起药物各种理化性质的变化， 主要对熔点、溶解度及溶出速率、稳定性、有效性的影响。,重点：以适宜的方法获得药物晶型的数据。常用方法：粉末X-衍射法红外吸收光谱法熔点热分析光学显微镜, 创新药物a. 不同结晶条件下（溶
16、剂、温度、结晶速率等）晶型的一致性；b. 不同晶型是否影响药物活性和毒性等;, 结构已知的仿制药品a. 力求与被仿制品保持一致；特别是被仿制药为晶型选择性药物，且各晶型的理化性质及生物药剂学性质有明显差异的仿制药品，要重点确定与被仿制品种晶型的完全一致性（熔点、红外吸收光谱、粉末X射线衍射图等)。b. 重点关注难溶性固体口服制剂晶型的研究；,3. 合成多肽类药物,氨基酸分析（证明多肽的组成是否正确）；质谱测定（提供相对分子质量及序列的信息）；序列分析以及肽图测绘等；紫外：对具有生色团结构的小肽有一定的测试意义；红外：适用于小肽（含三个氨基酸的肽）、拟肽等；核磁共振：可对小肽的结构提供部分信息；其他方法： HPLC、比旋度测定等。,药物结构中有半胱氨酸，应明确其状态（氧化态或还原态）；药物结构中存在二硫键，应明确二硫键的正确连接点；结合合成工艺对中间体的研究，对终产品的结构进行确证。,
