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1、,动物病原学实验,潘子豪,进入实验室的注意事项,1 穿工作服 2 书本等物品放入抽屉 3 树立无菌概念 4 不能抽烟、吃零食 5 爱护公物,注意节约,实验一 显微镜的构造和使用 及细菌形态结构的观察,一、目的要求: 1、了解显微镜的简单构造原理 2、学习掌握油镜的使用技术 3、观察细菌的基本形态 二、实验材料:普通光学显微镜 、香柏油、二甲苯、擦镜纸、标本玻片:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、枯草杆菌、炭疽杆菌 三、普通光学显微镜的基本结构 四、几种显微镜的简单原理1、暗视野 2、相差 3、荧光 4、电子 五、油镜的识别及使用和原理 六、使用完毕显微镜及标本片的处理 七、作业: 1、普通显微
2、镜与油镜使用上有何区别? 2、绘出你所观察到的细菌形态。,普通光学显微镜的简单原理,可见光 紫外光 电子衍射,分为光学显微镜和电子显微镜。光学显微镜又分为单式和复式。,使用前侧面注视,调节粗焦轮(物镜距玻片5mm);双目注视时,反时针调节粗焦轮,可见模糊镜像,顺时针调节细焦轮;每旋转一周粗焦,镜筒升降10mm,细焦0.002mm,先低倍后高倍;低倍使用时下降聚光器,高倍使用时上升聚光器。光线充足使用平面镜,光源不足使用凹面镜;使用高倍前先使用低倍选择目标视野,转移镜头换高倍,重新调节亮度。更换玻片时,重新低倍开始; 使用完毕后,仔细擦拭,一切归位。,四、油镜的识别及使用原理,1 光圈调最大 2
3、 标本上滴加香柏油0.5-1滴 3 转换油镜头浸入油滴中五、使用完毕显微镜及标本片的处理 油镜用过后,应立即用擦镜纸将镜头和玻片擦拭干净 如油渍已干,须用擦镜纸蘸少许二甲苯溶液拭去油渍,再用干擦镜纸拭净镜头,作业,1。普通显微镜与油镜使用上有何区别? 2。绘出你所观察到的细菌形态,变形杆菌 鞭毛特殊染色,枯草杆菌,革兰氏染色,枯草杆菌,芽胞简易染色,葡萄球菌,革兰氏染色,大肠杆菌,革兰氏染色,破伤风梭菌,芽胞染色,实验二 细菌抹片的制备方法、染色及显微镜观察,实验二 细菌抹片的制备方法、染色及显微镜观察,一、 目的要求: a) 掌握细菌抹片的制备方法 b) 掌握几种常用的染色方法和技术及无菌操
4、作技术 c) 巩固显微镜的使用,并了解细菌的染色特性、形态 二、 材料:炭疽杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌斜面,大肠杆菌肉汤 三、 制片及染色步骤:取干净玻片抹片干燥固定染色干燥镜检 四、 常用的几种染色方法 1、 革兰氏染色法 (1) 草酸铵结晶紫染液1-2分钟,水洗 (2) 革兰氏碘液媒染1-3分钟,水洗 (3) 95%酒精脱色30秒-1分钟,水洗 (4) 沙黄水溶液复染10-30秒,水洗 (5) 吸干,镜检 2、 姬姆萨染色法 (1) 甲醇固定3分钟,时间长短均可 (2) 姬姆萨液足量30分钟或数小时至24小时,水洗 (3) 吸干,镜检 3、 瑞氏染色法抹片干燥无需固定,直接滴加染液13分钟,
5、再加等量中性蒸馏水,轻轻混匀,续染15分钟水洗,吸干镜检 4、 美兰染色法:甲醇固定3分钟, 加上足量染液23分钟,水洗,吸干镜检 五、作业: 1、 根据实验体会,你认为制备染色标本时应该注意哪些事项? 2、 在你所做的革兰氏染色片中,大肠杆菌和炭疽杆菌各染成何色?它们是革兰阳性菌还是革兰阴性菌? 3、 作革兰氏染色时,涂片为什么不能过于浓厚?其染色成败关键一步是什么?,一、目的要求,1。掌握细菌抹片的制备方法 2。掌握几种常用的染色方法和技术及无菌操作技术 3。巩固显微镜的使用,了解细菌的染色特性、形态,二、材料,1、大肠杆菌:斜面、肉汤 金黄色葡萄球菌:斜面 炭疽杆菌:斜面 2、革兰染色液
6、、美兰染色液 3、载玻片、接种棒、酒精灯等,三、制片及染色步骤,取干净玻片-抹片-干燥-固定-染色-干燥镜检,1、玻片的处理:旧玻片有油,用95%酒精擦洗,然后在酒精灯上灼烧2、细菌抹片的制备:抹片 根据所用材料不同,抹片的方法也有差异。(1)固体培养物 用经酒精灯火焰烧过的接种环,蘸取生理盐水1-2环于清洁无油脂的载玻片中央,再勾取细菌的固体培养物少许混于生理盐水中,涂抹成直径为1-1.5cm大小的均匀的抹片。 (2)液体培养物 可直接用灭菌接种环勾取细菌培养物1-2环,涂抹于玻片上即可。但要注意将管底沉淀物摇匀,以免影响涂片效果。 (3)组织涂片 用灭菌的剪刀、镊子取被检组织一小块,以其断
7、面在玻片上压印或涂抹成适当大小的薄片。如为脓汁、血液、乳汁等可直接涂抹于玻片上。 (4)无论何种方法切忌涂片太厚,否则不利于染色和观察。,3、固定 (1)目的:1)、除去抹片上的水分,使菌体蛋白附着在载玻片上,以防染色过程中被水冲掉。2)、使抹片易于着色,变性的蛋白质着色力强。 3)、能杀死抹片中的部分微生物。(2)方法: 1)、火焰固定 将已干燥的抹片菌膜向上,以钟摆速度在酒精灯火焰上通过数次(以不烫手背为宜)。 2)、化学固定 加数滴甲醇于玻片上,固定2-3分钟,自然,四、常用的几种染色方法,1、革兰氏染色法 2、姬姆萨染色法 3、瑞氏染色法 4、美兰染色法,(一)革兰氏染色法,1。草酸铵
8、结晶紫染色1-2,水洗 2。革兰氏碘液媒染1-2,水洗 3。95%酒精脱色约30-1,水洗 4。沙黄水溶液复染10 -30 ,水洗 5。吸干,镜检,(二)姬姆萨染色法,1。甲醇固定3 ,时间长短均可 2。姬姆萨液足量30 或数小时至24h,水洗 3。吸干镜检,(三)瑞氏染色法,抹片干燥无需固定,直接滴加染色液 1-3 ,再加等量中性蒸馏水,轻轻混匀,续染15 ,水洗,吸干镜检,(四)美兰染色法,1。固定好抹片加上足量染液2-3 2。吸干镜检,注意事项,1、玻片要洁净无油,否则菌液涂不开 2、涂片不宜太厚,涂布时宜轻不宜重 3、保持无菌操作,试管开塞回塞前,管口消毒 4、接种棒使用前后一定要在火
9、焰上彻底灼烧灭菌,挑菌前待接种棒冷却后才用,作业,1。根据实验体会,你认为制备染色标本时应注意哪些事项? 2。在你所做的革兰氏染色片中,大肠杆菌和炭疽杆菌各染成何色?它们是革兰阳性还是阴性菌? 3。作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚?其染色成败关键一步是什么?,返回,实验三、培养基的制备,实验三、培养基的制备,一、 目的要求: 1、 掌握基础培养基制备的原则和要求; 2、 掌握一般培养基的制备过程及PH的测定 二、 实验材料:(略) 三、 操作方法: 1、普通肉汤的制备:按量称取加热溶解调PH 过滤分装灭菌菌检 分别称取牛肉膏 5g 蛋白胨10g NaCl 5g 磷酸氢二钾1g 蒸馏水1000
10、ml 置铝锅内加热溶解,取5ml肉汤于试管内,用0.1N NaOH校PH至7.4-7.6,并根据其用量计算所配培养基需用的1N NaOH量,调PH,测好PH后,取500ml肉汤至量筒,余下的倒入大烧杯用滤纸过滤,分装10根短试管,余下的装入盐水瓶。 2、普通琼脂培养基的制备:称取琼脂肉汤内溶化分装试管灭菌菌检 将量筒内的500ml肉汤倒入铝锅,加入10g琼脂条,加热溶解,加热中搅动,用纱布棉花过滤,分装长试管10管,余下装入盐水瓶。以上培养基分装完毕,捆扎好,每组做标记。 3、将分装好的培养基扎口后高压灭菌(121,20-30分钟)。 4、菌检 四、作业: 1、 制作培养基时应注意哪几点?为什
11、么高压灭菌前需调PH稍高些? 2、 测较少量肉汤培养基的酸碱度至PH7.6时,采用0.1N NaOH溶液,而将全部肉汤培养基调至PH7.6 时,却改用1N NaOH溶液,为什么? 3、 普通肉汤与普通琼脂培养基各有什么用途?,一 目的要求,1、掌握基础培养基制备的原则和要求 2、掌握一般培养基的制备过程及PH的测定,二 培养基的种类及用途,1、固体培养基:分离培养、纯培养、保存菌种 2、半固体培养基:细菌运动 3、液体培养基:观察细菌的生长状况、保存菌种,三、培养基制作的注意事项,1、细菌生长所需的营养物质 2、盛器均需无菌,不含抑菌物 3、必须符合生长要求 PH 4、要过滤,应为半透明或透明
12、 5、制好后需高压灭菌,四、培养基制备的一般过程,按量称取溶解调PH过滤 分装灭菌菌检,五、PH测定方法,1、 以空试管取5ml溶解的肉汤,用1ml滴管吸0.1N NaOH,滴定,边滴边测PH,PH7.6时,计量NaOH用量。算出实际用量。 2、改用1N NaOH调PH7.6。,基础培养基制备,1、配方: 牛肉膏5克 蛋白胨10克 NaCL5克 磷酸氢二钾1克 蒸馏水1000ml 2、按量称取溶解调PH过滤 分装10根短管灭菌菌检,琼脂培养基的制备,测好PH后,取500ml肉汤至量筒,余下的倒入大烧杯,把量出的500ml再倒入锅中,称量10g琼脂,边加热边搅动,看一下水位,补足水分。 琼脂完全
13、溶解后以棉花沙布过滤,分装10根长管。返回,作业,1、制作培养基时应注意哪几点?为什么高压灭菌前需调PH稍高些? 2、测较少量肉汤培养基的酸碱度至PH7.6时,采用0.1N NaOH溶液,而将全部肉汤培养基调至PH7.6时,却改用1N NaOH溶液,为什么? 3、普通肉汤与普通琼脂培养基各有什么用途?,实验四 细菌的分离培养及移植,一、目的要求 1、 掌握细菌分离培养的基本要领和常用方法 2、 使被检材料适当稀释,以求获得独立单在菌落 二、实验材料 1、培养基:普通琼脂平板 每人2块 普通琼脂斜面、普通肉汤 每人各1支 2、菌种:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌斜面、大金混合肉汤、感染大肠杆菌和金黄色
14、葡萄球菌的小白鼠 3、酒精灯、接种棒、剪刀、镊子、记号笔 三、需氧分离培养方法: 1、 平板分离培养法:平板划线法、倾注培养法(不常用) 2、 芽胞需氧分离培养法:80 1520分钟 杀死不耐热细菌 3、 化学药品分离培养法 4、 实验动物分离培养法 四、实验内容: 1、 平板划线法(组织平板)、(金+大)肉汤平板,每人二块 2、 肉汤培养(斜面肉汤),每人一支,(大)斜面肉汤 3、 斜面移植(斜面斜面),每人一支,(金)斜面斜面 接种完标明细菌、日期、自己的记号,置37,恒温箱培养24小时(平板倒置),第二天抽时间看培养结果。 五、作业 1、 何谓纯培养?分离纯培养的目的何在? 2、 在挑取
15、固体培养物上的细菌作平板划线时,为什么每次都要将接种环上剩余的细菌烧掉? 3、 为什么要把培养皿倒置培养?,1、 平板划线法(组织平板)、(金+大)肉汤平板,每人二块2、 肉汤培养(斜面肉汤),每人一支,(大)斜面肉汤 3、 斜面移植(斜面斜面),每人一支,(金)斜面斜面,一、目的要求,1、掌握细菌分离培养的基本要领和常用方法 2、使被检材料适当稀释,以求获得独立单在菌落,实验材料,菌种:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌斜面大肠杆菌金黄色葡萄球菌混合肉汤 实验动物:感染了大肠杆菌金黄色葡萄球菌的小白鼠 培养基:普通琼脂平板、斜面、,二、需氧分离培养方法,1、平板划线分离培养法:平板划线法、倾注培养法(不常用)2、芽胞需氧分离培养法:80 1520分钟 杀死不耐热细菌,再接种至平板3、化学药品分离培养法:抑菌作用杀菌作用鉴别作用4、实验动物分离培养法:本种动物或小鼠,三、实验内容,1、平板划线法(金黄色葡萄球菌+大肠杆菌肉汤平板),每人一块,小鼠肝脏平板,每人一块 2、肉汤培养(斜面肉汤),每人一支,大肠杆菌斜面肉汤 3、斜面移植(斜面斜面),每人一支,金黄色葡萄球菌斜面斜面,标记,接种完毕标明细菌、日期、自己的记号,试管置37,恒温箱培养24小时(平板倒置),第二天下午抽时间看培养结果。,