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1、,动物病原学实验,潘子豪,进入实验室的注意事项,1 穿工作服 2 书本等物品放入抽屉 3 树立无菌概念 4 不能抽烟、吃零食 5 爱护公物，注意节约,实验一 显微镜的构造和使用 及细菌形态结构的观察,一、目的要求： 1、了解显微镜的简单构造原理 2、学习掌握油镜的使用技术 3、观察细菌的基本形态 二、实验材料：普通光学显微镜 、香柏油、二甲苯、擦镜纸、标本玻片:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、枯草杆菌、炭疽杆菌 三、普通光学显微镜的基本结构 四、几种显微镜的简单原理1、暗视野 2、相差 3、荧光 4、电子 五、油镜的识别及使用和原理 六、使用完毕显微镜及标本片的处理 七、作业： 1、普通显微
2、镜与油镜使用上有何区别？ 2、绘出你所观察到的细菌形态。,普通光学显微镜的简单原理,可见光 紫外光 电子衍射,分为光学显微镜和电子显微镜。光学显微镜又分为单式和复式。,使用前侧面注视，调节粗焦轮（物镜距玻片5mm）；双目注视时，反时针调节粗焦轮，可见模糊镜像，顺时针调节细焦轮；每旋转一周粗焦，镜筒升降10mm，细焦0.002mm，先低倍后高倍；低倍使用时下降聚光器，高倍使用时上升聚光器。光线充足使用平面镜，光源不足使用凹面镜；使用高倍前先使用低倍选择目标视野，转移镜头换高倍，重新调节亮度。更换玻片时，重新低倍开始； 使用完毕后，仔细擦拭，一切归位。,四、油镜的识别及使用原理,1 光圈调最大 2
3、 标本上滴加香柏油0.5-1滴 3 转换油镜头浸入油滴中五、使用完毕显微镜及标本片的处理 油镜用过后，应立即用擦镜纸将镜头和玻片擦拭干净 如油渍已干，须用擦镜纸蘸少许二甲苯溶液拭去油渍，再用干擦镜纸拭净镜头,作业,1。普通显微镜与油镜使用上有何区别？ 2。绘出你所观察到的细菌形态,变形杆菌 鞭毛特殊染色,枯草杆菌，革兰氏染色,枯草杆菌，芽胞简易染色,葡萄球菌，革兰氏染色,大肠杆菌，革兰氏染色,破伤风梭菌，芽胞染色,实验二 细菌抹片的制备方法、染色及显微镜观察,实验二 细菌抹片的制备方法、染色及显微镜观察,一、 目的要求： a) 掌握细菌抹片的制备方法 b) 掌握几种常用的染色方法和技术及无菌操
4、作技术 c) 巩固显微镜的使用，并了解细菌的染色特性、形态 二、 材料：炭疽杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌斜面，大肠杆菌肉汤 三、 制片及染色步骤：取干净玻片抹片干燥固定染色干燥镜检 四、 常用的几种染色方法 1、 革兰氏染色法 （1） 草酸铵结晶紫染液1-2分钟，水洗 （2） 革兰氏碘液媒染1-3分钟，水洗 （3） 95%酒精脱色30秒-1分钟，水洗 （4） 沙黄水溶液复染10-30秒，水洗 （5） 吸干，镜检 2、 姬姆萨染色法 （1） 甲醇固定3分钟，时间长短均可 （2） 姬姆萨液足量30分钟或数小时至24小时，水洗 （3） 吸干，镜检 3、 瑞氏染色法抹片干燥无需固定，直接滴加染液13分钟，
5、再加等量中性蒸馏水，轻轻混匀，续染15分钟水洗，吸干镜检 4、 美兰染色法：甲醇固定3分钟， 加上足量染液23分钟，水洗，吸干镜检 五、作业： 1、 根据实验体会，你认为制备染色标本时应该注意哪些事项？ 2、 在你所做的革兰氏染色片中，大肠杆菌和炭疽杆菌各染成何色？它们是革兰阳性菌还是革兰阴性菌？ 3、 作革兰氏染色时，涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败关键一步是什么？,一、目的要求,1。掌握细菌抹片的制备方法 2。掌握几种常用的染色方法和技术及无菌操作技术 3。巩固显微镜的使用，了解细菌的染色特性、形态,二、材料,1、大肠杆菌：斜面、肉汤 金黄色葡萄球菌：斜面 炭疽杆菌：斜面 2、革兰染色液
6、、美兰染色液 3、载玻片、接种棒、酒精灯等,三、制片及染色步骤,取干净玻片-抹片-干燥-固定-染色-干燥镜检,1、玻片的处理：旧玻片有油，用95%酒精擦洗，然后在酒精灯上灼烧2、细菌抹片的制备：抹片 根据所用材料不同，抹片的方法也有差异。（1）固体培养物 用经酒精灯火焰烧过的接种环，蘸取生理盐水1-2环于清洁无油脂的载玻片中央，再勾取细菌的固体培养物少许混于生理盐水中，涂抹成直径为1-1.5cm大小的均匀的抹片。 （2）液体培养物 可直接用灭菌接种环勾取细菌培养物1-2环，涂抹于玻片上即可。但要注意将管底沉淀物摇匀，以免影响涂片效果。 （3）组织涂片 用灭菌的剪刀、镊子取被检组织一小块，以其断
7、面在玻片上压印或涂抹成适当大小的薄片。如为脓汁、血液、乳汁等可直接涂抹于玻片上。 （4）无论何种方法切忌涂片太厚，否则不利于染色和观察。,3、固定 （1）目的:1)、除去抹片上的水分，使菌体蛋白附着在载玻片上，以防染色过程中被水冲掉。2)、使抹片易于着色，变性的蛋白质着色力强。 3)、能杀死抹片中的部分微生物。（2）方法： 1)、火焰固定 将已干燥的抹片菌膜向上，以钟摆速度在酒精灯火焰上通过数次（以不烫手背为宜）。 2)、化学固定 加数滴甲醇于玻片上，固定2-3分钟，自然,四、常用的几种染色方法,1、革兰氏染色法 2、姬姆萨染色法 3、瑞氏染色法 4、美兰染色法,（一）革兰氏染色法,1。草酸铵
8、结晶紫染色1-2，水洗 2。革兰氏碘液媒染1-2，水洗 3。95%酒精脱色约30-1，水洗 4。沙黄水溶液复染10 -30 ，水洗 5。吸干，镜检,（二）姬姆萨染色法,1。甲醇固定3 ，时间长短均可 2。姬姆萨液足量30 或数小时至24h，水洗 3。吸干镜检,（三）瑞氏染色法,抹片干燥无需固定，直接滴加染色液 1-3 ，再加等量中性蒸馏水，轻轻混匀，续染15 ，水洗，吸干镜检,（四）美兰染色法,1。固定好抹片加上足量染液2-3 2。吸干镜检,注意事项,1、玻片要洁净无油，否则菌液涂不开 2、涂片不宜太厚，涂布时宜轻不宜重 3、保持无菌操作，试管开塞回塞前，管口消毒 4、接种棒使用前后一定要在火
9、焰上彻底灼烧灭菌，挑菌前待接种棒冷却后才用,作业,1。根据实验体会，你认为制备染色标本时应注意哪些事项？ 2。在你所做的革兰氏染色片中，大肠杆菌和炭疽杆菌各染成何色？它们是革兰阳性还是阴性菌？ 3。作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败关键一步是什么？,返回,实验三、培养基的制备,实验三、培养基的制备,一、 目的要求： 1、 掌握基础培养基制备的原则和要求; 2、 掌握一般培养基的制备过程及PH的测定 二、 实验材料:（略） 三、 操作方法： 1、普通肉汤的制备：按量称取加热溶解调PH 过滤分装灭菌菌检 分别称取牛肉膏 5g 蛋白胨10g NaCl 5g 磷酸氢二钾1g 蒸馏水1000
10、ml 置铝锅内加热溶解，取5ml肉汤于试管内，用0.1N NaOH校PH至7.4-7.6，并根据其用量计算所配培养基需用的1N NaOH量，调PH，测好PH后，取500ml肉汤至量筒，余下的倒入大烧杯用滤纸过滤，分装10根短试管，余下的装入盐水瓶。 2、普通琼脂培养基的制备：称取琼脂肉汤内溶化分装试管灭菌菌检 将量筒内的500ml肉汤倒入铝锅，加入10g琼脂条，加热溶解，加热中搅动，用纱布棉花过滤，分装长试管10管，余下装入盐水瓶。以上培养基分装完毕，捆扎好，每组做标记。 3、将分装好的培养基扎口后高压灭菌（121，20-30分钟）。 4、菌检 四、作业： 1、 制作培养基时应注意哪几点？为什
11、么高压灭菌前需调PH稍高些？ 2、 测较少量肉汤培养基的酸碱度至PH7.6时，采用0.1N NaOH溶液，而将全部肉汤培养基调至PH7.6 时，却改用1N NaOH溶液，为什么？ 3、 普通肉汤与普通琼脂培养基各有什么用途？,一 目的要求,1、掌握基础培养基制备的原则和要求 2、掌握一般培养基的制备过程及PH的测定,二 培养基的种类及用途,1、固体培养基：分离培养、纯培养、保存菌种 2、半固体培养基：细菌运动 3、液体培养基：观察细菌的生长状况、保存菌种,三、培养基制作的注意事项,1、细菌生长所需的营养物质 2、盛器均需无菌，不含抑菌物 3、必须符合生长要求 PH 4、要过滤，应为半透明或透明
12、 5、制好后需高压灭菌,四、培养基制备的一般过程,按量称取溶解调PH过滤 分装灭菌菌检,五、PH测定方法,1、 以空试管取5ml溶解的肉汤，用1ml滴管吸0.1N NaOH，滴定，边滴边测PH，PH7.6时，计量NaOH用量。算出实际用量。 2、改用1N NaOH调PH7.6。,基础培养基制备,1、配方： 牛肉膏5克 蛋白胨10克 NaCL5克 磷酸氢二钾1克 蒸馏水1000ml 2、按量称取溶解调PH过滤 分装10根短管灭菌菌检,琼脂培养基的制备,测好PH后，取500ml肉汤至量筒，余下的倒入大烧杯，把量出的500ml再倒入锅中，称量10g琼脂，边加热边搅动，看一下水位，补足水分。 琼脂完全
13、溶解后以棉花沙布过滤，分装10根长管。返回,作业,1、制作培养基时应注意哪几点？为什么高压灭菌前需调PH稍高些？ 2、测较少量肉汤培养基的酸碱度至PH7.6时，采用0.1N NaOH溶液，而将全部肉汤培养基调至PH7.6时，却改用1N NaOH溶液，为什么？ 3、普通肉汤与普通琼脂培养基各有什么用途？,实验四 细菌的分离培养及移植,一、目的要求 1、 掌握细菌分离培养的基本要领和常用方法 2、 使被检材料适当稀释，以求获得独立单在菌落 二、实验材料 1、培养基：普通琼脂平板 每人2块 普通琼脂斜面、普通肉汤 每人各1支 2、菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌斜面、大金混合肉汤、感染大肠杆菌和金黄色
14、葡萄球菌的小白鼠 3、酒精灯、接种棒、剪刀、镊子、记号笔 三、需氧分离培养方法： 1、 平板分离培养法：平板划线法、倾注培养法（不常用） 2、 芽胞需氧分离培养法：80 1520分钟 杀死不耐热细菌 3、 化学药品分离培养法 4、 实验动物分离培养法 四、实验内容： 1、 平板划线法（组织平板）、（金+大）肉汤平板，每人二块 2、 肉汤培养（斜面肉汤），每人一支，（大）斜面肉汤 3、 斜面移植（斜面斜面），每人一支，（金）斜面斜面 接种完标明细菌、日期、自己的记号，置37，恒温箱培养24小时（平板倒置），第二天抽时间看培养结果。 五、作业 1、 何谓纯培养？分离纯培养的目的何在？ 2、 在挑取
15、固体培养物上的细菌作平板划线时，为什么每次都要将接种环上剩余的细菌烧掉？ 3、 为什么要把培养皿倒置培养？,1、 平板划线法（组织平板）、（金+大）肉汤平板，每人二块2、 肉汤培养（斜面肉汤），每人一支，（大）斜面肉汤 3、 斜面移植（斜面斜面），每人一支，（金）斜面斜面,一、目的要求,1、掌握细菌分离培养的基本要领和常用方法 2、使被检材料适当稀释，以求获得独立单在菌落,实验材料,菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌斜面大肠杆菌金黄色葡萄球菌混合肉汤 实验动物：感染了大肠杆菌金黄色葡萄球菌的小白鼠 培养基：普通琼脂平板、斜面、,二、需氧分离培养方法,1、平板划线分离培养法：平板划线法、倾注培养法（不常用）2、芽胞需氧分离培养法：80 1520分钟 杀死不耐热细菌，再接种至平板3、化学药品分离培养法：抑菌作用杀菌作用鉴别作用4、实验动物分离培养法：本种动物或小鼠,三、实验内容,1、平板划线法（金黄色葡萄球菌+大肠杆菌肉汤平板），每人一块，小鼠肝脏平板，每人一块 2、肉汤培养（斜面肉汤），每人一支，大肠杆菌斜面肉汤 3、斜面移植（斜面斜面），每人一支，金黄色葡萄球菌斜面斜面,标记,接种完毕标明细菌、日期、自己的记号，试管置37，恒温箱培养24小时（平板倒置），第二天下午抽时间看培养结果。,
